Kilittaşı Bağırsak Bacterium Christensenella minuta’dan Yeni Bir Safra Tuzu Hidrolazının Tanımlanması

Özet: Christensenella minuta, bağırsak mikrobiyomunun ana üyeleri olarak önerilen, konakçının enerji dengesini ve adipozitesini düzenleyen insan bağırsağında yaşayan bakterilerdir. Daha önce, yeni bir C. minuta suşunun (DSM33407) mikrobiyota çeşitliliğini artırdığını ve insan numunelerinde ana safra asidi taurokolik asidin dekonjugasyonunu uyardığını tespit etmiştik. Ancak, C. minuta genomunda taşınan bir safra tuzu hidrolaz (BSH) proteininin tanımı yoktur. Burada, tercihen glisin ile konjuge safra asitlerini dekonjuge eden güçlü bir BSH aktivitesi taşıyan C. minuta genomundan bir protein belirledik ve klonladık. Daha sonra, NCBI veri tabanından 14,319 varsayılan BSH dizisini aldık ve UHGP veri tabanını kullanarak, şimdiye kadar insan mikrobiyomunda tanımlanan BSH ile ilgili enzimlerin en kapsamlı filogenetik ağacını oluşturmak için kullanılan toplam 6701 diziyi toplamak için filtreledik. Bu filogenetik ağaç, C. minuta’nın BSH amino asit dizi topluluğunun %70 özdeşlik eşiği ile diğerlerinden uzaklaştığını ortaya çıkarmıştır. Bu nedenle bu, insan bağırsağı mikrobiyal ekosistemindeki benzersiz rolüne dahil olabilecek C. minuta’nın BSH proteininin ilk tanımıdır.

Anahtar Kelimeler: bağırsak mikrobiyomu; safra asitleri; safra tuzu hidrolazı

1. Giriş

Christensenella minuta, adipozitenin anahtar modülatörü olarak öne sürülen Firmicutes şubesinin düşük bollukta Gram-negatif insan bağırsağı kommensal bir bakteri türüdür [1,2]. Ayrıca, birkaç insan obez topluluğunda sürekli olarak azaldığı rapor edilmiştir, bu da enerji metabolizmasının düzenlenmesi ile ilişkili benzersiz bir işlev taşıdığını düşündürmektedir [1,3-6]. Bugüne kadar, Morotomi ve ark. 2012 yılında tanımladıkları orjinal tip suşu olan C. Minuta’nın yalnızca bir suşu (DSM 22607, metinde daha sonra CmDSM22607 olarak anılacaktır) kültür koleksiyonlarında mevcuttur  [7]. Yakın zamanda yayınlanan bir çalışmada, diyetle indüklenen obezite (DIO) fare modelinde yeni Christensenella minuta DSM 33407 (CmDSM33407) suşunun anti-obezite potansiyelini gösterdik [8]. Bu makalede ayrıca, bir SHIME® modeli kullanarak bu yeni suşun obez donörlerin bağırsak mikrobiyomu üzerindeki etkilerini değerlendirdik ve bağırsak bakteri çeşitliliğini desteklediğini, bir disbiyotik obez mikrobiyota için tipik olan Bacteroides/Firmicutes oranını değiştirip düzenlediğini gösterdik [9]. Bu etki, kısa zincirli yağ asitlerinin (SCFA’lar) üretiminin uyarılmasıyla ilişkiliydi ve kolonun distal kısmında kolik asit/taurokolik asit (CA/TCA) oranını artırma eğilimindeydi [8], C. minuta DSM 33407 ile desteklenen mikrobiyotanın fonksiyonu, birincil safra asitlerinin daha verimli dekonjugasyonu ile bağlantılı daha yüksek bir sakkarolitik metabolizmaya doğru değiştirildiğini göstermiştir.

Safra asidi metabolizmasının, kolesterol homeostazına katkıda bulunan enterohepatik döngü yoluyla geri dönüşümlerini kolaylaştırdıkları için bağırsak mikropları tarafından düzenlendiği uzun zamandır bilinmektedir [10]. Üst gastrointestinal sistemde safra asitleri, enerji dengesinin düzenlenmesinin önemli bir yönü olan lipid emilimini düzenlemektedir [11,12]. Bu iyi bilinen işlevin ötesinde, safra asitleri ayrıca sinyal molekülleri olarak hareket ettikleri ve Farnesoid X Reseptörü (FXR) ve Takeda G protein Reseptörü 5 (TGR-5) tarafından kontrol edilen metabolik yollar aracılığıyla konakçı tepkilerini tetikledikleri için bağırsak mikrobiyomu-konakçı metabolizması çarpraz karışmasının anahtar aracılarıdır [10]. Bu nedenle, enerji, bağışıklık ve hatta beyin metabolizmalarında yer alan çeşitli sistemik işlevleri düzenleyen bağırsak mikrobiyotasından türetilen hormonlar olarak önerilmiştir [13,14].

Safra asidi dekonjugasyonu, konjuge safra asitlerinin amino asit yan zincirinin hidrolizini katalize eden bir koloilglisin hidrolaz enzimi olan bakteriyel enzim Safra Tuzu Hidrolaz (BSH; EC 3.5.1.24) yoluyla bağırsakta meydana gelmektedir [11]. Bu etki, pasif difüzyon ile konjuge olmayan safra asitlerinin yeniden emilimini kolaylaştırır ve bakteriler tarafından ikincil safra asitleri (örn., deoksikolik ve litokolik asit) üretmek için daha fazla metabolizmaya izin vermektedir. Önemli bir biçimde, BSH enzimleri yapısal olarak penisilin asilazlara (EC:3.5.1.11) ve asit seramidazlara (EC:3.5.1.23) yakındır, bu da otomatik ek açıklamaları kullanan yüksek girdi-çıktı biyoinformatik yöntemlerle onların tanımlanmasını zorlaştırmaktadır. 

BSH aktivitesi; bağırsakla ilişkili bakterilere özgü ve gastrointestinal sistemdeki ana bakteri bölümleri ve arke türleri arasında dağılmış, korunmuş bir mikrobiyal adaptasyondur. Aslında BSH; Bifidobacterium spp. [15,16], Lactobacillus spp. [17,18], Enterococcus spp. [19] ve Methanobrevibacter spp. gibi üzerinde iyi çalışılmış birkaç bağırsak mikropunda tanımlanmıştır [20]. BSH’lerin çoğu Gram pozitif organizmalarda çalışılmış olmasına rağmen, BSH’ler yakın zamanda Gram negatif Bacteroides spp.’de ilginç seçicilik modellerini ortaya çıkarmak için araştırılmıştır [21]. Biyoinformatik analizler BSH enzimlerinin tüm etnik kökenlerde insan bağırsak mikrobiyomunda yaygın olarak kodlandığını göstermiştir [22]. Bağırsak mikrobiyotasının birçok üyesinde bu enzimin korunmasının nedenlerinden birinin, taşıyıcılarına evrimsel bir avantaj sağlayarak safra asidi toksisitesi direncine katkısı olduğu öne sürülmüştür [23]. Fakat, bu görüşe meydan okunmuştur [24] ve yakın zamanda yapılan bir çalışma, BSH enzimlerinin safra asitlerine yanıt olarak bakterinin transkriptomunu  modüle ettiğini ve dolayısıyla onların çevreye uyumunu sağladığını göstermektedir [17]. İlginç bir şekilde, tip türü C. minuta DSM22607 (CmDSM22607) safra asitlerine karşı oldukça toleranslı olarak tanımlanmıştır [7], bu da safra asitlerini detoksifiye etmede oldukça verimli bir moleküler motora sahip olduğunu düşündürmektedir. Bu nedenle, CmDSM33407’nin işlevsel bir BSH taşıdığını varsaydık. Burada, CmDSM33407’nin spesifik BSH’sini ilk kez tanımlıyoruz.

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. Bakteriyel Büyüme ve Safra Asidi Tolerans Testi

Christensenella minuta DSM 22607 (NCBI erişim no. NZ_CP029256.1) ve DSM 33407, önceden indirgenmiş Gifu anaerobik modifiye ortamında (GAMm, Hyserve, Uffing, Almanya) 3 gün boyunca 37°C’de anaerobik koşullar altında büyütülmüştür (Coy anaerobik hazne; H₂ %5, CO₂ %5, N₂ %90). Tüm safra asidi substratları (yani, OxGall, GCA, GCDCA, TCA ve TCDCA) Sigma-Aldrich’ten (Merck, Darmstadt, Almanya) satın alınmıştır.

C. minuta DSM22607 ve DSM33407’nin safra asitlerinin varlığında büyüme yeteneği %0, %2, %4, %6, %8 w/v OxGall (BD Diagnostics tarafından sağlanan Difco Laboratories, Le Pont de Claix, Fransa; üreticinin açıklamasına göre %0, %20, %40, %60 ve %80 safraya eşdeğer) ile takviye edilmiş 10 mL modifiye GAM ortam sıvı besiyeri (Hyserve, Uffing, Almanya) içinde değerlendirilmiştir. Her durum, 72 saatlik büyümeden sonra toplanan C. minuta suşlarının bir ön kültürü ile %1 v/v’de aşılanmıştır. Bakteri kültürü daha sonra anaerobik koşullar altında 37°C’de 96 saat süreyle inkübe edilmiştir. Test iki kopya halinde yapılmıştır. Büyüme kültürü, bir Biowave Hücre Yoğunluk Metresi CO8000 (Biochrom Ltd., Cambridge, UK) kullanılarak küvetlerde optik yoğunluk (OD 600 nm) 0 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat ve 96 saatte ölçülerek değerlendirilmiştir. Her durumdaki bakteri canlılığını belirlemek için, modifiye GAM agar plakalarında 48. ve 96. saatlerde CFU sayımı yapılmış ve anaerobik koşullar altında 37°C’de 5 gün inkübe edilmiştir. 

2.2. C. minuta DSM 33407 BSH Geninin Klonlanması

C. minuta DSM33407’nin BSH geninin tam uzunluktaki ORF’sinin PCR ile amplifiye edilmiş fragmanları, Cm33407BSH-F (5′-TACTTCCAATCCAATGCCATGTGTACAGCAATAACGTATTATACAAA-3′) ve Cm33407BSH-R (5′-TTATCCACTTCCAATGTTATTAGTAATTCCGATAGTTAATCTGCTG-3′) primerleri ile Q5 yüksek kaliteli polimeraz (New England Biolabs, Evry, Fransa) kullanılarak elde edilmiştir. Sonraki ligasyon için uygun pMCSG tamamlayıcı dizileri içeren PCR ürünleri, bir N-terminal His₆ etiketi [25,26] sağlayan pMCSG53 plazmitine klonlanmıştır. Başarılı klonlama, seçilen kolonilerden (Ozyme, Paris, Fransa’dan Taq’Ozyme polimeraz) hedef gen parçasının (978 bp) amplifiye edilmesiyle doğrulanmış ve DNA dizilimi için gönderilmiştir (Genewiz, Leipzig, Almanya). 

2.3. Ekspresyon ve Rekombinant BSH

Rekombinant proteinler 37°C’de (200 rpm) ampisilin (50 μg.mL^-1) içeren 500 mL LB sıvı besiyerinde kültürlenen E. coli BL21 (DE3) hücrelerinde üretilmiştir. Hücreler orta üstel faza (OD₆₀₀ ~ 0.4 ile 0.6) büyütülmüştür. 0.5 mM’lik bir nihai konsantrasyona izopropil β-D-tiogalaktopiranosid (IPTG) eklenerek aşırı ekspresyon indüklenmiş ve kültürler, 18 saat boyunca 16°C’de (200 rpm) daha da büyütülmüştür. Hücreler santrifüjleme yoluyla toplanmış (4°C’de 20 dakika boyunca 7000 X g), ultrasanik banyoda tutulmuş ve His₆ etiketli rekombinant proteinler, 20 mM sodyum fosfat, pH 7.4, 500 mM NaCl ve bir Akta Pure protein saflaştırma FPLC sistemi (Cytiva, Marlborough, MA, ABD) kullanılarak  500 mM imidazol içeren %100’e kadar elüsyon tamponuna kadar tek aşamalı bir gradyan elüsyonu kullanılarak hareketsizleştirilmiş nikel afinite kromatografisi (His-Trap; Cytiva, Marlborough, MA, ABD) yoluyla saflaştırılmıştır. Rekombinant proteinlerin saflığı, SDS/PAGE ile belirlenmiş ve nihai konsantrasyon, bir Nanodrop One (Thermofisher Scientific, Illkirch, Fransa) kullanılarak 280 nm’de hesaplanan molar yok olma katsayılarından saptanmıştır. 

2.4. Enzimatik Testler

Bir florometrik glisin deney kiti (ab211100, abcam, Paris, Fransa) ve bir kolorimetrik taurin deney kiti (Merck, Darmstadt, Almanya) sırasıyla ön safra asiti dekonjugasyon deneyinde saf bakteri lizatlarının hareketiyle salınan glisin ve taurin miktarlarını belirlemek için kullanılmıştır. Saflaştırılmış rekombinant BSH’nin aktivitesi, Tanaka ve meslektaşları tarafından tanımlandığı gibi ninhidrin deneyi kullanılarak konjuge safra tuzlarından salınan amino asitlerin miktarı ölçülerek belirlenmiştir [27]. Kısaca, 180 μL reaksiyon tamponuna (0.1 M sitrat tamponu, pH 6.0), 10 μL saflaştırılmış Cm33407BSH, 10 μL 100 mM safra asidi (GCA: glikokolik asit, GCDCA: glikokonodeoksikolik asit, TCA: taurokolik asit, TCDCA: taurokenodeoksikolik asit) ve 10 mM ditiotreitol (DTT) eklenmiştir. Reaksiyon 37°C’de gerçekleştirilmiştir. Ayrıca enzimsiz ve denatüre enzimli (10 dakika, 90°C) bir kontrol reaksiyonuda gerçekleştirilmiştir. Belirli bir reaksiyon süresinden sonra 50 μL’lik bir numune alınmış ve hemen 50 μL %15 (w/v) trikloroasetik asit ile karıştırılmıştır. Bu numune, çökeltiyi uzaklaştırmak için 2 dakika 16,000 X g’de santrifüjlenmiştir. Bu birinci reaksiyonun 50 μL’lik bir alikuotı daha sonra 950 μL ninhidrin reaktifi (0,5 M sitrat tamponu pH 5,5’de %1 (w/v) ninhidrinin 0,25 mL’si; 0,6 mL gliserol; ve 0,5 M sodyum sitrat tamponu pH 5.5’nın 0,1 mL’si) ile karıştırılmıştır. Karışım 13 dakika kaynatılmış ve 3 dakika buz üzerinde soğutulmuştur. 570 nm’de absorbans ölçülmüştür. 

2.5. Protein Dizisi ve Siliko Yapısal Analiz

Tam uzunluktaki protein Cm33407BSH, SignalP (versiyon 5.0), LipoP 1.0 ve PSORTb [28-30] kullanılarak varsayılan bir sinyal peptit dizisinin varlığı açısından taranmıştır. Temsili BSH dizileri ile hizalamalar, Clustal Omega [31] ve ESPript 3 yazılımı [32] kullanılarak sağlanmıştır. ESPript 3.0’da sıkı β-dönüşleri TT harfleri olarak, sıkı α-dönüşleri TTT olarak gösterilir ve η sembolü bir 310 sarmalına atıfta bulunur. Cm33407BSH’nin 3D modeli, Phyre2 web portalı [33] aracılığıyla gelişmiş uzaktan homoloji saptama yöntemleri kullanılarak elde edilmiştir. Yapı temsilleri PyMOL Moleküler Grafik Sistemi (v2.4.0, Schrödinger tarafından) kullanılarak yapılmıştır.

2.6. BSH Hizalama, Filogenetik Analiz ve Kümeleme

C. minuta DSM 22607’den alınan BSH protein dizisi, NCBI protein veri tabanından okunmuştur (GenBank: AYH40638.1). C. minuta DSM 22607 ve DSM 33407’den elde edilen BSH’nin amino asit dizileri, varsayılan parametrelerle Muscle (v.3.8.31) kullanılarak hizalanmış ve hizalama, MView [34,35] kullanılarak görüntülenmiştir.

İnsan bağırsağından alınan 6701 varsayılan BSH dizisinden oluşan bir veri seti, Şekil S1’de gösterilen akış şeması kullanılarak oluşturulmuştur. Kısaca; açıklamalarına, uzunluklarına ve kaynaklarına dayalı olarak NCBI refseq protein veri tabanından toplam 14,319 dizi seçilmiştir. Diziler, Birleştirilmiş İnsan Gastrointestinal Proteini (UHGP-100 v1.0, 2 Aralık 2020’de indirildi) kataloğuna ve İnsan Mikrobiyom Projesi’nden (HMP) [36–39] alınan gastrointestinal sistem protein veritabanına karşı püskürtülmüştür (Blastp v2.9.0+). NCBI refseq protein veri tabanından 14,319 varsayılan BSH dizisinden, UHGP veri tabanının en az bir dizisiyle %85 veya daha fazla özdeşliği paylaşan diziler, insan bağırsağından 6701 varsayılan BSH dizisinden oluşan bir veri seti oluşturmak üzere seçilmiştir. %70 kimlik eşiği ve 4 kelime boyutu kullanılarak bu veri setinde CD-hit (v.4.6.1) kullanılarak bir kümeleme analizi yapılmıştır.

Her ağaç için, seçilen diziler varsayılan parametrelerle [34] Muscle (v.3.8.31) kullanılarak sıralanmıştır. Hizalamadaki farklı ve zayıf hizalanmış dizileri ortadan kaldırmak için varsayılan parametrelere sahip Gblock’lar (v0.91b) kullanılmıştır [40]. macOS için MEGA-X (v10.1.8); filogenetik ağacı oluşturmak için kullanılmıştır [41,42]. İlk ağaç, komşu birleştirme kullanılarak elde edilmiş ve yeniden örnekleme değerlerini doğrulamak için 1000 yineleme kullanılarak maksimum olabilirlik yöntemi kullanılarak kontrol edilmiştir.

3. Sonuçlar

3.1. Christensenella minuta DSM 33407 Yüksek Görüntüleniyor

CmDSM22607’nın safra asitlerine direnci başlangıçta safraya karşı oldukça toleranslı olarak tanımlanmıştır [7]. Bu nedenle, ilk önce yeni CmDSM33407 suşunun safra asidi direnci potansiyelini değerlendirdik ve bunu CmDSM22607 tip suşu ile karşılaştırdık. Bu amaçla her iki suşun büyümesi, artan konsantrasyonlarda okside edilmiş safra asitlerinin bir karışımı (yani, OxGall tozu) ile takviye edilmiş veya edilmemiş modifiye GAM broth (sıvı besiyeri) ortamında incelenmiştir (Şekil 1A,B). Her iki suşda safranın %80’ine eşdeğer olan %8 OxGall varlığında hala gelişebildiği için iki suşun da safra asitlerine karşı oldukça dirençli olduğunu gözlemledik. Sonuçlarımız, %20’ye kadar safra varlığında safrasız kontrol durumuna benzer bir büyüme göstermiştir. Daha sonra büyüme, daha yüksek safra konsantrasyonlarında (safranın %40’ına kadar veya %4 OxGall’a kadar) biraz azalmış ve her iki suş için daha yüksek safra konsantrasyonlarında büyüme kontrolü ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde inhibe edilmiştir (Şekil 1A,B). 

48 saat ve 96 saat inkübasyondan sonra farklı safra konsantrasyonlarında hayatta kalan hücrelerin oranını belirlemek için, her durum için Koloni Oluşturan Birim (CFU)/mL’yi hesaplamak amacıyla 10 kat seri seyreltmeler plakalanmıştır (Şekil 1C,D). Genel olarak, CmDSM33407 ve CmDSM22607 için 48 saat sonra %8 OxGall varlığında sırasıyla %49 ve %31 büyüme inhibisyonuna ulaşan; CmDSM22607 ile karşılaştırıldığında CmDSM33407’nin safra asitlerine maruz kalmasına karşı daha yüksek bir duyarlılık gözlemledik. Yinede bu sonuçlar, yüksek konsantrasyonlarda safra asidi stresine dayanmada güçlü bir yeteneği göstermektedir. Bu tür direnç mekanizmalarına tipik olarak hücre zarı oluşumu ve yapısı, akış pompalarının varlığı ve BSH gibi detoksifiye edici enzimlerin eylemleri tarafından aracılık edilmektedir. 

Şekil 1. Christensenella minuta DSM 33407’nin safra asidi direnci. Safra tuzları kaynağı olarak OxGall kullanılarak (A) Christensenella minuta DSM 33407 ve (B) C. minuta DSM22607 için safra asidi direnç profili. Büyüme engelleme yüzdesi, karşılık gelen OxGall konsantrasyonlarının varlığında 48 saat ve 96 saat büyümeden sonra (C) Christensenella minuta DSM 33407 ve (D) C. minuta DSM 22607 için CFU sayımı yapılarak elde edilmiştir. Tüm deneyler, CFU sayımları (C ve D; tekrar yok) dışında üç kopya halinde gerçekleştirilmiştir. Anahtar: OxG: OxGall.

3.2. Christensenella minuta DSM 33407 ve DSM 22607  Aktif Safra Tuzu Hidrolaz Enzimi Taşır

CmDSM33407 daha ileri bir ön aktivite taramasında konjuge safra asitlerini hidrolize etme kabiliyetine dayalı olarak bir BSH geninin tanımlanması için seçilmiştir (Şekil 2A,B). BSH aktivitesi, durağan büyüme fazı sırasında toplanan bakteri kültürlerinden test edilmiştir. Hücre süspansiyonları parçalanmış ve doğal safra asitleri (OxGall), GCDCA ve TCDCA karışımına karşı varsayılan bir BSH aktivitesini ölçmek için kullanılmıştır. Tipik bir enzimatik reaksiyonda serbest glisin ve serbest taurin salınımı, BSH ile konjuge safra asitlerinden glisin ve taurin hidrolizinin bir göstergesi olarak ölçülmüştür. Şekil 2A,B’de gösterildiği gibi, CmDSM33407’den elde edilen hücre lizatı, üç substrattan glisin ve taurin salınımında güçlü bir yetenek göstermiştir, bu da bakterilerin aktif bir BSH proteini ifade ettiğini göstermektedir.

Şekil 2. Christensenella minuta DSM 33407 tarafından safra asidi dekonjugasyonu. 72 saatlik büyümeden sonra toplanan C. minuta DSM 33407’nin bakteri hücresel lizatları tarafından OxGall, GCDCA ve TCDCA’dan glisin (A) ve taurin (B) salınımının miktar tayini. Tüm deneyler üç kopya halinde yapılmiştir. Anahtar: OxG: OxGall, GCDCA: glikochenodeoksikolik asit, TCDCA: taurokenodeoksikolik asit.

Böylece, varsayılan BSH genlerini hızlı bir şekilde tanımlamak için, CmDSM33407 ve CmDSM22607’nin genom dizileri, koloilglisin hidrolaz (konjuge safra asidi hidrolazı, CBAH, EC:3.5.1.24), penisilin asilaz (EC:3.5.1.11) ve asit seramidaz (EC:3.5.1.23) içeren lineer amid CN hidrolaz proteinleri için taranmıştır. Biyoinformatik analizimiz bu çalışmaya dahil edilen her iki Christensenella minuta suşunun; bir varsayılan BSH, Cm33407BSH (GenBank: MZ028606) ve Cm22607BSH (GenBank: AYH40638.1) kodladığını belirlemiştir. Her iki protein dizisi kesinlikle aynıdır ve Cm33407BSH dizisi 325 amino asit kalıntısı  içermektedir (Şekil S2). Yapısal olarak tanımlanmış BSH ve PVA (Penisilin Vasilaz) dizileri ile dizi hizalaması, Enterococcus faecalis T2 (BSH), Clostridium perfringens (BSH), Bifidobacterium longum (BSH), Lactobacillus salivarius (BSH), Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 (BSH) ve Lysinibacillus sphaericus (PVA) ile sırasıyla %67,9, %45,37, %38,14, %54,63, %20,47 ve %31,48 özdeşlik sergilemiştir (Şekil 3).

Amino asit dizisi hizalaması, ikincil yapı organizasyonunun ve Cys2, Arg16, Asp19, Asn79, Asn170 ve Arg223 anahtar aktif bölge kalıntılarının korunduğunu ortaya çıkarmıştır (numaralandırma Cm33407BSH dizisine göre yapılır; çoklu dizi hizalamasında siyah yıldızlar olarak vurgulanır) daha önce büyük koloilglisin hidrolaz ailesi (CGH) içinde tarif edildiği gibi [43] (Şekil 3A). Cys2, katalitik nükleofilik kalıntı görevi görür. İlginç bir fark, analizimize dahil edilen Lysinibacillus sphaericus’den dizisi tarafından örneklendiği gibi, PVA üyeleri içinde genellikle aromatik bir amino asit (Phe, Tyr, Trp) ile değiştirilen Asn79’dur. Ayrıca, dört kıvrım  içindeki kalıntılar ılımlı olarak değiştirilmiştir (Şekil 3A; kesikli dikdörtgen): 15–25 (kıvrım 1), 55–65 (kıvrım 2), 127–142 (kıvrım 3), 258–270 (kıvrım 4). Bu dört kıvrım, CGH ailesinin substrat bağlama bölge arketipini oluşturur. Kayda değer amino asit farklılıkları, yalnızca Cm33407BSH’de gözlenen, kıvrım 1, 2 ve 4 içinde yer alan Leu18, Leu20, Y65 ve E269 kalıntılarıdır. Bu kalıntıların, substrat bağlama adımında [44] önemli olduğu gösterilmiştir.

Cm33407BSH, bir Enterococcus faecalis BSH (EfBSH; PDB kodu 4WL3 [19]) ile %68 dizi özdeşliği paylaşmış ve bu nedenle üçüncül yapı homoloji modellemesine uygundur. Bir protein yapısı tahmin yazılımı olan Phyre2 [33], tek şablon olarak PDB kodu 4WL3’ü kullanmış ve 325 kalıntıdan 321’i (dizinin %99’u) %100 güvenle modellenmiştir (Şekil 3B). Genel olarak model, Cm33407BSH’nin α-sarmallar arasına sıkıştırılmış iki antiparalel β-tabaka sunduğunu ve N-terminal nükleofil (Ntn)-hidrolaz süper ailesinin çekirdek katalitik dört katmanlı αββα katını benimsediğini ileri sürer. Cm33407BSH’nin EfBSH ile birleştirilmiş yapısı, onların yapıları arasında benzerlikler ortaya çıkarmış ve katalitik aktif bölgeleri nükleofil kalıntısını (Cys2) içermektedir (Şekil 3C). Özellikle, substrat bağlama bölgesini oluşturan dört kıvrım ve ayrıca protein multimerini tutan bir  birleştirme kıvrımı modellenmiştir. Bağlanma ve kataliz için tüm önemli kalıntılar, Leu 18 ve Leu 20’nin çarpıcı farkıyla, bağlanma bölge konformasyonunu koruyarak iki protein arasında korunur. Aslında, EfBSH’deki iki aromatik ve hidrofobik kalıntı F18 ve Y20, aromatik bir halkası olmayan daha hidrofobik bir amino asit olan Leu kalıntısı tarafından yer-değiştirilir.

Şekil 3. C. minuta DSM33407 ve temsili BSH ve PVA üyelerinden BSH’nin yapı bazlı protein dizisinin hizalanması. (A) Numaralandırılmış 325 amino asidin tam protein dizi hizalaması. Erişim numaraları ve referanslar için Tablo S1’e bakın. Korunan kalıntılar kırmızıyla vurgulanır. Siyah yıldızlar, koloilglisin hidrolaz süper ailesinde korunan amino asit kalıntılarını göstermektedir. Siyah üçgenler, önceki çalışmalarda kataliz ve substrat bağlanmasında önemli olduğu gösterilen amino asit kalıntılarını göstermektedir [43]. Kesikli siyah dikdörtgenler, dört substrat bağlama bölgesi kıvrımını göstermektedir (ayrıca panel (B)’de sunulur). (B) Cm33407BSH’nin üçüncül yapı homoloji modeli. Bir Enterococcus faecalis str. T2’den (EfBSH; PDB ID 4WL3 [19], açık pembe) BSH ile bir BSH Phyre2 homoloji modelinin [33] (açık mavi) üstdüşümü. (C) Dört substrat bağlama bölgesi kıvrımının üst üste bindirilmiş görüntüsü ve Cm33407BSH ile EfBSH’nin karşılaştırılması. Resim sırasıyla 18 ve 20 konumunda bulunan Cm33407BSH kalıntıları için EfBSH ve Leucines (“L”) (açık mavi) için Fenilalanin (“F”) ve Tirozinin (“Y”) (açık pembe) dikkate değer istisnası ile sırasıyla 2, 65 ve 269 pozisyonlarında Sistein (“C”), Tirozin (“Y”) ve Glutamik asit (“E”) dahil olmak üzere dört kıvrımdaki ana kalıntıların korunmasını gösterir. Anahtar: Efaeca: Enterococcus faecalis T2; Cm33407: C. minuta DSM33407; Cperfr: Clostridium perfringens; Blongu: Bifidobacterium longum; Lsaliv: Lactobacillus salivarius; Btheta: Bacteroides thetaiotaomicron; Lsphae: Lysinibacillus sphaericus.

3.3. Cm33407BSH, C. minuta DSM33407’de Güçlü Bir BSH Aktivitesi Taşır

Cm33407BSH, steroid çekirdeğinden konjuge amino asidi ortadan kaldırmak için varsayılan safra tuzu hidrolazının yeteneğini araştırmak için Escherichia coli’de rekombinant olarak üretilmiştir. SignalP, LipoP ve PSORTb ile yürütülen sinyal peptid analizinde ne tip I/II sinyal peptidleri ne de N-terminal Cys lipidasyonu öngörülmemiştir, bu da enzimin hücre içi lokalizasyonunu göstermektedir [28-30]. Cm33407BSH kodlayan geni barındıran pMCSG53 ekspresyon vektörü, proteini aşırı eksprese  etmek için E. coli BL21’e (DE3) dönüştürülmüştür. IPTG indüksiyonu  ve nikel afinite kromatografisi ile saflaştırmadan sonra, SDS-PAGE’de rekombinant Cm33407BSH proteininin (39,966.71 Da) hesaplanan moleküler kütlesine karşılık gelen yaklaşık 40 kDa’da bir rekombinant Cm33407BSH tek protein bandı gözlemlenmiştir (Şekil 4A). 

Şekil 4. Saflaştırılmış Cm33407BSH’nin spesifik BSH aktivitesi. (A) Rekombinant Cm33407BSH proteininin SDS-PAGE’si (rekombinant Cm33407BSH’nin hesaplanan moleküler ağırlığı 39.97 kDa’dır). (B) Dört ana birincil konjuge safra asidi üzerinde C. minuta DSM33407’den saflaştırılmış BSH’nin spesifik aktivitesi. Tüm deneyler üç kopya halinde gerçekleştirilmiştir. Anahtar: GCA: glikokolik asit, GCDCA: glikochenodeoksikolik asit, TCA: taurokolik asit, TCDDCA: taurokenodeoksikolik asit.

Cm33407BSH’nin hidrolitik aktivitesini ve substrat spesifikliğini belirlemek için rekombinant protein, dört ana glisin veya taurin konjuge safra tuzuna karşı taranmıştır. Cm33407BSH’nin aile üyeliğine bağlı olarak glisin-konjuge safra asitleri üzerinde maksimum düzeyde aktif olacağını tahmin ettik. Böylece, rekombinant proteinin optimal pH’ını belirlemek için GCA substratını kullandık. 50 mM sitrat tamponunda pH 5.0’da gözlemlenen en yüksek enzimatik aktivite ile çan şeklinde bir pH oranı profili elde edilmiştir (Şekil S2). Ayrıca, rekombinant protein Cm33407BSH, glisin konjugatları GCA ve GCDCA için yüksek spesifik aktivite değerleri (sırasıyla 1.073 ± 0.1 µmol.min^-1.mg^-1 ve 1.074 ± 0.17 µmol.min^-1.mg^-1) (Şekil 4B) görüntülenmiştir oysa taurin konjugatları için onun spesifik aktivitesi, test edilen en yüksek substrat konsantrasyonunda (5mM) TCA (0.26 ± 0.09 μmol.min^-1.mg^-1) ve TCDCA (0.5 ± 0.13 μmol.min^-1.mg^-1) için yaklaşık 4.2 ve 2.2 kat daha düşüktür. Birlikte bu Cm33407BSH’nin doğal substratlar olarak glisin-konjuge safra asitleri için güçlü bir tercihe sahip olduğunu göstermektedir. 

3.4. C. minuta sp. Kümeleri Tarafından Taşınan BSH Proteini, İnsan Bağırsak Mikrobiyomunda Tanımlanmış tüm Varsayılan BSH Dizilerinden Ayrılır

Biz daha sonra Cm33407BSH’nin bilinen insan metagenomları içinde ne kadar spesifik olduğunu sorgulamaya karar verdik ve bu nedenle insan bağırsak mikrobiyotasının kurucu üyeleri arasında BSH dağılımını inceledik. BSH ailesi içindeki dizi çeşitliliğini araştırmak için, ilk önce bu aileyle ilişkilendirilebilecek tüm mevcut referans BSH dizilerinin halka açık veritabanlarından gerekli bir setini topladık. Şekil S1’deki akış şemasında açıklandığı gibi, ilk önce NCBI protein veri tabanından koloilglisin hidrolaz, safra tuzu hidrolaz, lineer amid C-N hidrolaz ve koloilglisin hidrolaz ailesi proteini olarak açıklamalı tüm protein dizilerini aldık. Bu adım, varsayılan şekilde BSH enzimleri olarak açıklamalı toplam 14,319 diziyi almamıza olanak tanımıştır (Tablo S2). Bu veri setini yalnızca insan bağırsağında bulunabilen dizileri seçerek saflaştırmak için, 14,319 dizinin tümünü gastrointestinal sistem İnsan Mikrobiyom Projesi (HMP) protein veri tabanına ve Birleştirilmiş İnsan Gastrointestinal Protein (UHGP) veri tabanına karşı püskürttük [36,38 ,39]. Burada, UHGP püskürtmesi bu eşikte 5179 diziyi sağlarken, HMP veri tabanı bir BSH dipnotuyla %100 özdeşlikte yalnızca 1658 diziyi yakaladığından büyük ölçüde farklı sonuçlar elde ettik (Şekil S3, Tablo S3). Bu nedenle, insan mikrobiyotası tarafından taşınan proteinlerin temsili bir kataloğu olarak UHGP açıklamalı dizileri kullanarak analize devam etmeye karar verdik. %85’lik bir minimum özdeşlik eşiği kullanılarak 14,319 diziden 6701’i, insan bağırsağından varsayılan BSH proteinleri olarak alınmıştır (ham verilerin bir listesi için bkz. Şekil S1 ve Tablo S4). Bu dizilerin tümü, 0’lık bir E-değeri ile ilişkilendirilmiştir ve en düşük kapsam %86’dır ve bu, veri setinin genel kalitesine yüksek güven verir. İnsan bağırsak mikrobiyomundan varsayılan BSH dizilerinin filogenetik ağacını oluşturmak için, bu 6701 diziyi, %70 özdeşlik eşiği kullanarak 413 dizi kümesine grupladık (ham veriler için Tablo S5’e bakın). 413 kümenin referans dizileri bir filogenetik analiz gerçekleştirmek için kullanılmıştır: diziler hizalanmış ve elde edilen filogenetik ağaç Şekil 5’te sunulmuştur. Ağacın topolojisine dayalı olarak, 16 ana küme tanımlanmıştır (ham veriler için Tablo S6’ya bakınız). Christensenella alt kümesi böylece büyük ölçüde Enterococcus spp. dizilerinin baskın olduğu BSH-C1 kümesi (Şekil 5) içinde tanımlanmıştır. C1 kümesinin ayrıntılı bir analizi, C. minuta’nın BSH dizisinin diğer herhangi bir bakteri grubundan ayrı bir dalda izole edildiğini göstermiştir (Şekil 6). Ağaçtaki her dal, %70 veya daha fazla özdeşliği paylaşan bir dizi kümesini temsil ettiğinden, her dal, herhangi diğer dallara karşı %70’den az özdeşliğe sahip dizileri izole eder. Şekil 6’da bir parantez ile gösterilen alt kümeyi tekrar yakınlaştırarak, C. minuta’nın BSH dizilerinin Christensenellaceae dizilerinin belirli bir kümesi içinde yer aldığını belirledik (ham veriler için bkz. Şekil S5 ve Tablo S7). Böylece, C. minuta’nın BSH dizileri, bağırsak mikrobiyotasında bulunan varsayılan BSH protein dizilerinin diğerlerinden açıkça farklıdır. 

Şekil 5. İnsan bağırsağından BSH’lerin filogenetik ağacı. İnsan bağırsağından alınan 6701 BSH dizisinden oluşan bir veri seti, Malzemeler ve Yöntemler bölümünde açıklandığı gibi seçilmiş ve işlenmiştir. Ağacın etrafındaki pasta grafikler, her BSH kümesi için bahsedilen cinslere ait dizilerin sayısını göstermektedir (ham veriler için Tablo S6’ya bakın). Yıldız işareti, Christensenellaceae dalının yaklaşık konumunu göstermektedir. Semboller, karakterize edilen BSH’nin bulunabileceği dalların yaklaşık konumunu gösterir (†: WP_002355428.1, PDB yapısı 4WL3 ile; §: WP_003461725.1, PDB yapısı 2BJF ile; ‡: WP_013410903.1, PDB yapısı 2HF0 ile; 

: WP_047036229.1; PDB yapısı 5HKE ile; X: WP_008761025.1; PDB yapısı 6UFY ile).

Şekil 6. BSH-C1 kümesinin filogenetik ağacı. Bootstrap değerleri her dalda gösterilmektedir. Enterococcus faecalis’ten karakterize edilen BSH’yi içeren kümenin dalı kalın harflerle yazılmıştır (†: WP_002355428.1, PDB yapısı 4WL3 ile). C. minuta’nın BSH dizisini içeren dal kırmızı renktedir. Parentez içindeki kümelerden gelen diziler, Şekil S4’te gösterilen filogenetik ağacı üretmek için Malzemeler ve Yöntemler bölümünde belirtildiği gibi alınmış ve işlenmiştir. 

4. Tartışma

Bu çalışmanın amacı, Christensenellaceae türleri Christensenella minuta tarafından aktif bir BSH enziminin heterolog ekspresyonunu keşfetmekti. Gerçekten de bu türün 325 amino asitlik tam ve korunmuş bir BSH dizisini kodladığını belirledik. Enzim hem taurin- hem de glisin- konjuge safra asitlerini hidrolize edebilse bile, glisin-konjuge safra asitleri için daha yüksek aktiviteye sahip olduğunu gösterdik. Steroidal çekirdek yapılar (yani, kolik asit ve kenodeoksikolik asit) arasında herhangi bir aktivite farkı gözlemlemedik. Henüz bu çalışmada sadece insan birincil safra asitlerini test ettik ve bakteriyel metabolizmayı takiben bağırsakta doğal olarak oluşan diğer steroid yapılarını araştırmadık, murin birincil safra asitlerinden biri olan beta-mürikolik asidine karşı aktiviteyi de test etmedik. 

BSH ailesi büyük ölçüde başlıca bakteri filumlarında (Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria) ve hatta bağırsak ekosistemindeki yaşam alanlarında (bakteri ve arke) temsil edilmektedir [20,43]. Bu her yerde bulunan temsil, protein ailesinin safra asidi direncinde önemli bir rol oynayan bakteri fizyolojisindeki önemini yansıtmaktadır [45]. Sonuç olarak, BSH enzimleri büyük ölçüde patojenlerde ve potansiyel olarak faydalı bakterilerde ve çoğunlukla Gram pozitif bakterilerde çalışılmıştır [13,17,46,47]. Bunun aksine, yalnızca sınırlı sayıda Gram negatif BSH değerlendirilmiştir buda Bacteroides türlerinden BSH’tir [21]. İlginç bir şekilde, Gram-negatif bakterilerin bağırsakta yaşayan topluluğundan gelen seçici BSH enzimleri, tauro-konjuge safra asitleri [21] için rapor edilmiştir, ancak glisin için rapor edilmemiştir, biz burada glisin özgüllüğüne sahip yeni bir BSH proteinini tanımlıyoruz. Glisin-konjuge safra asitleri için nispi özgüllüğü göz önüne alındığında bu; C. minuta’nın insan bağırsağına kolonize olmak için iyi adapte olduğunu göstermektedir, çünkü insanlar tercihen glisin konjugatları üretirken kemirgenler ve özellikle fareler tercihen tauro-konjuge safra asitleri üretmektedirler [48]. 

Bu çalışmada, Cm33407BSH’nin optimum aktivitesinin, daha önce karakterize edilen BSH’ler (3.8 ile 7.0 arasında değişen optimum pH’lar) ve insan kalın bağırsağındaki pH profili ile [43,49,50] tutarlı olan 5.0 pH’da gerçekleştiğini belirledik. İlginç bir şekilde, gliko-konjuge safra tuzlarının toksisitesinin, özellikle düşük pH’larda, tauro-konjuge formlardan önemli ölçüde daha yüksek olduğu bulunmuştur [51,52]. Ancak, spesifik bakteri suşları için konjuge ve dekonjuge safra asitlerinin nispi toksisitesi hala belirsizdir. Mikrobiyal safra asidi direncinin, sindirim yolu ortamında başarılı bir kolonizasyona katkıda bulunduğu iyi bilinmektedir [48]. Ayrıca, Lactobacillus spp.’de yürütülen yakın tarihli bir çalışmada, BSH substrat özgüllüğü ve konakçıyı etkili bir şekilde kolonize etmek için bakteriyel uygunluk arasındaki bağlantı incelikle gösterilmiştir [17]. Bu nedenle birlikte ele alındığında, verilerimiz Cm33407BSH’nin; CmDSM33407 için gözlemlenen yüksek safra asidi direncine katkıda bulunabileceğini ve konakçılarını kolonize etmek için dönüşümsel bir avantaj sağlayan bir safra detoksifikasyon rolü oynayabileceğini göstermektedir [20,53,54]. 

Üç boyutlu bilgi, substrat özgüllüğü ve kataliz hakkında bilgi sağlamanın anahtarıdır. Örneğin kıvrımlar, bağlanma bölgesinin hacmini belirleyeceğinden, substrat bağlanmasını ve özgüllüğünü belirlemek için kritik öneme sahiptir [43,55]. Böylece, kıvrım yapılarındaki ince değişiklikler BSH’nin katalitik aktivitesini önemli ölçüde etkileyebilir. Çalışmamızın bir sınırlaması, deneysel üçüncül yapı tayini için Cm33407BSH kristallerini elde etmeye çalışmamış olmamızdır. Ancak, BSH’lerin birkaç üçüncül yapıları halka açıktır [16,19,56-58]. Böylece, burada mevcut en yakın nispi BSH modelinden oluşturulmuş üçüncül bir yapısal model sağlıyoruz ve sadece birkaç anahtar amino asit kalıntısının bağlanma bölgesinin yapısında yer alan kısımlarda değiştirildiğini gösteriyoruz. F18, Y20 ve Y65’in EfBSH için daha yüksek bir aktiviteye yol açan bir oryantasyonda substrat hizalaması önerilmiştir ve hem C2 hem de Y20 eşik bekçisi olarak rol oynamaktadır [19]. F18 ve Y20’nin her ikisi de Cm33407BSH’de daha hidrofobik lösin kalıntıları ile değiştirildiğinden ve filogenetik ağaçtaki nispi yakınlıklarına rağmen, enzim etkinliğinin Enterococcus faecalis modelinden farklı olması muhtemeldir. Benzer şekilde, enzimin glisin-konjuge safra asitlerine karşı spesifik aktivitesine dahil olduğu tanımlanan L. salivarius ‘ta (PDB ID 5HKE) bir Y65 modifikasyonu gözlemledik [55,56]. Bunu doğru bir şekilde belirlemek için daha fazla çalışma yapılmalıdır. Yinede bu gözlemler C. minuta’nın BSH’sinin ayırt edici doğasını güçlü bir şekilde desteklemektedir.

Sonuç olarak, bağırsak ekosisteminin çeşitliliği ile ilgili olarak Cm33407BSH dizisini değerlendirmek için bağırsak mikrobiyomunda varsayılan BSH dizilerinin dağılımını araştırdık. Bu analizi gerçekleştirmek için, halka açık tüm varsayılan BSH dizilerinin bir dizi kataloğunu toplamamız gerekiyordu. Benzer bir koleksiyon türü yakın zamanda Song ve arkadaşları tarafından yayınlanmıştır [22] ancak C. minuta’nın BSH geni lineer bir amid C-N hidrolaz olarak halka açık bir şekilde açıklanması nedeniyle bu diziler gözden kaçmıştır. Böylece, metotlarımızı bu doğrultuda ayarladık ve NCBI refseq protein veritabanından (Şekil S1) koleksiyonumuza 9000’den fazla ek dizi ekledik. Bunu yaparak, bugüne kadar bağırsak mikrobiyomlarındaki varsayılan BSH dizilerinin en kapsamlı analizini gerçekleştirdik. Ayrıca Song ve arkadaşları yaptıkları çalışmada sadece HMP kataloğunu kullanmışlardır, bizim analizimiz ise UHGP veri tabanının kullanılmasının insan bağırsak mikrobiyomundan varsayılan BSH proteinlerinin daha doğru bir şekilde tanımlanmasına olanak sağladığını göstermiştir. Almeida ve arkadaşları [36] tarafından belirtildiği gibi, UHGP veri tabanı kültürlenmiş bağırsak mikrobiyotasından alınan referans genomlar ve çeşitli çalışmalardan elde edilen Metagenom Birleştirilmiş Genomlar (MAG’ler) kullanılarak oluşturulmuştur. Dolayısıyla UHGP veri tabanı yaklaşık 4650 prokaryottan 200,000’den fazla gereksiz olmayan genomdan oluşturulurken, HMP gastrointestinal sistem protein veri tabanı sadece 457 benzersiz genom içermektedir. UHGP veri tabanındaki bu ek çeşitlilik, insan bağırsağı mikrobiyomundan varsayılan BSH dizilerinin tanımlanmasında artan bir özgünlüğe olanak sağlamıştır. İlginç bir şekilde, filogenetik analiz tarafından tanımlanan 16 ana BSH kümesinde temsil edilen türlerin yanı sıra dizilerin sayısı, iki parametre arasında herhangi bir açık korelasyon olmaksızın kümeler arasında eşit değildir (Şekil S6). Bunun Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Bacillus spp., Salmonella spp., Bacteroides spp. ve Lactobacillus spp. [18,19,21] gibi birkaç cins üzerinde çok sayıda çalışmanın sebep olduğu bir yanlılığın sonucu olduğunu varsayıyoruz. Yinede, C. minuta’nın BSH’si, hem dizi sayısı hem de cins sayısı bakımından en çeşitli kümelerden birine dahil olmasına rağmen (Şekil S6) filogenetik analiz, bu BSH’nin amino asit dizisinin benzersiz olduğunu ortaya koymuştur. Benzer şekilde BSH enzimlerinin yapısının karakterizasyonunda, temel olarak çok çalışılan cinslere (Tablo S1’deki mevcut yapılar) odaklanılmıştır. Bu gözlemler, insan bağırsağındaki BSH enzimlerinin çeşitliliği hakkında daha fazla bilgi edinmek için C. minuta gibi bağırsak mikrobiyomundan nadir türlerin araştırılması için daha fazla çalışmaya ihtiyaç olduğunu göstermektedir.  

Safra tuzu hidrolizi, safra asidi metabolizmasının ilk adımıdır. Konjuge olmayan safra tuzlarının çoğu daha sonra ya bağırsak epiteli yoluyla pasif olarak yeniden emilir ya da terminal ileumda aktif olarak yeniden emilir. Safra asidi havuzunun sadece %5’i, ikincil safra asidi üretimi ile sonuçlanmak üzere daha fazla metabolizmaya uğrayacağı kolona gitmektedir [59]. Konjuge olmayan safra tuzları bakteriler için oldukça toksiktir ve böylece onlar mikrobiyal topluluğun önemli düzenleyicileri olarak hareket etmektedirler [60]. Bu nedenle, BSH aktivitesini düzenlemek, bağırsak ekosistemi kompozisyonunu etkilemenin etkili bir yoludur. Aksine, kronik inflamatuar bağırsak bozukluğu Crohn hastalığında [61,62] hasarlı bir BSH aktivitesi rapor edilmiştir ve bu, BSH aktivitesini in vivo değerlendirmek için son zamanlarda invazif olmayan bir tanı aracının geliştirilmesine bile yol açmıştır [63]. Bir başka terapötik uygulama; yakın zamanda fekal mikrobiyal transplantasyon (FMT) ile etkili bir şekilde tedavi edilen  tekrarlayan Clostridioides difficile enfeksiyonları için gösterilmiştir. İyi bir çalışmada, Mullish ve arkadaşları FMT’nin hastalarda BSH aktivitesini restore ettiğini ve bunun in vitro enfeksiyonu temizlemek için yeterli olduğunu ortaya koymuştur [64]. Böylece, insan bağırsağında BSH aktivitesini onarmayı amaçlayan yeni terapötik yaklaşımlar geliştirmeye artan bir ilgi vardır. Metabolik bozukluklar bağlamında yakın tarihli bir çalışmada, obez olmayan karaciğer fibrotik bireylerinin bağırsak mikrobiyomlarında BSH kodlayan genlerin önemli ölçüde daha düşük kopya sayısı sergilediği bildirilmiştir [65].

Hayvan modellerinde in vivo olarak, bağırsak ekosisteminde artan BSH aktivitesinin daha düşük vücut ağırlığı kazanımına, daha düşük adipozite ve dolaşımdaki düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) kolesterol ve trigliseritlerin azalmasına yol açtığı gösterilmiştir [12]. Bu çalışma aynı zamanda oldukça aktif bir BSH taşıyan bakteri suşları ile bağırsak mikrobiyomlarını zenginleştirmenin aşırı vücut ağırlığını hafifletmek için bir strateji olabileceğini öne sürmektedir. CmDSM33407’nin hayvan modellerinde güçlü anti-obezite etkileri sunduğu göz önüne alındığında [8] BSH aktivitesi, daha ileri çalışmaları garanti eden onun etki mekanizmasında önemli bir kilit taşı işlevi olabilir. 

5. Sonuçlar

Sonuç olarak, yeni bir BSH enzimini işlevsel olarak inceledik, böylece kilit taşı bağırsak bakterisi C. minuta tarafından safra asidi metabolizmasını anlamamızdaki anahtar olan tamamlanmamış bir eksikliği çözümledik. Bu fonksiyon, sağlıklı bağırsak ekosistemlerinde bu tür tarafından oynanan ana role katılabilir ve bu, C. minuta’nın safra asidi metabolizmasının modülasyonları yoluyla konakçının nasıl fayda sağladığını tam olarak anlamak için daha fazla çalışmayı garanti eder.