Probiyotik Akkermansia muciniphila’nın D-galaktoz/AlCl3 aracılı Alzheimer hastalığı benzeri sıçanlar üzerindeki önleyici etkileri
ÖZET
Amaçlar: A. muciniphila’nın oral uygulanmasının periodontitise sahip AD benzeri fareler üzerindeki etkilerini ve onun olası mekanizmasını araştırmak için AlCl3 ve D-galaktoz enjekte edilen AD benzeri fare modelleri oluşturulmuştur.
Ana metotlar: Bilişsel bozukluğu ve kemik kaybını değerlendirmek için Morris su labirenti testi ve mikro-BT kullanılmıştır; Aβ1–42 birikimi, IHC tarafından test edilmiş; LAL Testi ve biyokimyasal testler ile serum LPS düzeyi ve TG, HDL-C ve AST/ALT düzeyleri saptanmıştır; Bağırsak mikrobiyotası, 16S rRNA gen dizisi ile analiz edilmiştir.
Anahtar bulgular: A. muciniphila’nın AD benzeri farelerin bilişsel bozukluklarını hafifletebileceği ve ligatür kaynaklı periodontitisi hafifletebileceği bulunmuştur. Ayrıca, A. muciniphila farelerin beyninin korteks ve bölgelerinde Aβ1-42 birikimini azaltmış ve TG, HDL-C ve AST/ALT seviyelerini değiştirmiştir ancak dolaşımdaki LPS seviyesini değiştirme ve kan-beyin bariyerini geçme kabiliyeti çok azdı. Özellikle, A. muciniphila tedavisi; Blautia, Staphylococcus ve Lactococcus gibi bazı kısa zincirli yağ asidi (KZYA) üreten veya nörotransmitter üreten bağırsak mikrobiyomlarının bolluğunu artırabilirken inflamasyonla ilişkili patojenik Aerococcus ve Streptococcus’un bolluğunu azaltmıştır.
Önem: Bu çalışma bulguları A. muciniphila’nın potansiyel olarak bağırsak mikrobiyal topluluğunun bileşimini ve işlevini değiştirmesi veya periferik dolaşım metabolizmasını düzenlemesi aracılığıyla bağırsak-beyin eksenini düzenleyerek AD benzeri patolojiler üzerinde geriletici bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir.
Kısaltmalar: AD, Alzheimer Hastalığı; Aβ, amiloid-β; SCFA, kısa zincirli yağ asidi; CMC, Karboksimetilselüloz; MWM, Morris Su Labirenti; LPS, lipopolisakarit; BV/TV, kemik hacmi/doku hacmi; CEJ, diş minesi-sement birleşimi; ABC, alveolar kemik kret; Hipp, hipokampus; Ctx, korteks; TG, Trigliseritler; AST, Aspartat aminotransferaz; ALT, Alanin aminotransferaz; HDL-C, yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol; UA, ürik asit; LDL-C, düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol; BBB, kan-beyin bariyeri; HDL, yüksek yoğunluklu lipoprotein; LDL, düşük yoğunluklu lipoprotein; TC, toplam kolesterol; CNS, merkezi sinir sistemi; GABA, gama-aminobütirik asit.
1. Giriş
Alzheimer hastalığı (AD), ilerleyici bilişsel bozuklukla karakterize kronik nörodejeneratif bir hastalıktır, dünya çapında yaşlı yetişkinler arasında demansın en önemli nedenlerinden biridir. Yakın zamandaki epidemiyolojik tahminler, 2050’de demanslı hasta sayısının 2010’a göre üç katın üzerine çıkacağını ve çoğu demans vakasının AD’den kaynaklanabileceğini göstermektedir (Barnes ve Yaffe, 2011; Norton vd. 2014). Ayrıca, artan yaşam beklentisi ve yaşam ortamının sürekli değişmesiyle 2050 yılına kadar 85 kişiden 1’inin Alzheimer hastası olacağı tahmin edilmektedir (Brookmeyer vd. 2007). Son birkaç on yılda bilim adamları, AD’nin beyinde amiloid-β (Aβ) peptidinin aşırı üretimi ve birikmesi ile yakın ilişki içinde olduğunu öne sürmüşlerdir, ancak altta yatan mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Özellikle mevcut çalışmaların çoğu; enfeksiyonun AD’nin nedenlerinden biri olma olasılığını destekleyen Aβ peptidin antimikrobiyal aktiviteleri hakkındaki son keşif için, inflamasyonun AD gelişimi ve ilerleyici bilişsel bozulma için önemli bir patolojik itici güç olduğunu desteklemektedir, Aβ plak oluşumunun ve gelişiminin enfeksiyon tarafından indüklenebileceğini düşündürmektedir (Vigasova vd. 2021). Ayrıca, kronik periodontitisin kilit taşı patojeni olan Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), AD hastalarının Aβ plaklarında ve beyinlerinde saptanmıştır, bu da periodontitis ile AD arasındaki yakın ilişkiyi düşündürmektedir (Dominy vd. 2019). Daha sonraki klinik deneylerde, periodontitisten muztarip kişilerde AD riskinin arttığı, bu arada AD’li kişilerin azalan bilişsel yetenek ve bozulmuş ağız sağlığı nedeniyle periodontitis, diş kaybı ve mukozal hastalıktan muzdarip olma olasılığının daha yüksek olduğu bulunmuştur (Sun vd. 2020).
Akkermansia muciniphila (A. muciniphila), birincil karbon kaynağı olarak saflaştırılmış mukus proteini kullanan insan bağırsak mikroplarının tek temsilcisi ve kültürlenebilir Verrucomicrobia’dır, bu nedenle besin kullanımının düşük olduğu ortamlarda bile hayatta kalabilir. A. muciniphila, sağlıklı bireylerde bağırsak mikrobiyal topluluğunun %3-5’ini oluşturabilmekte (Barnes ve Yaffe, 2011), özellikle kolonda, aynı zamanda ağız boşluğu, pankreas, safra sistemi ve apendiks gibi diğer anatomik kısımlarda da bulunmaktadır (Geerlings vd. 2018). Daha önceki birçok araştırmada, çeşitli inflamatuar hastalıklarda A. muciniphila bolluğunun azaldığı ve bu probiyotiğin çoklu terapötik özellikleri gösterilmiştir (Zou ve Chen, 2020). Periodontitis hastalarının (Petrukhina vd. 2016) ve AD hastalarının (Harach vd. 2017) bağırsaklarında A. muciniphila bolluğunun önemli ölçüde azaldığına dair çok sayıda kanıt rapor edilmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda, A. muciniphila’nın P. gingivalis tarafından ortaya çıkan iltihaplanmaya karşı koyabileceği ortaya konmuştur (Huck vd. 2020; Mulhall vd. 2020), bu da A. muciniphila’nın anti-inflamatuar özellikleri aracılığıyla periodontite karşı potansiyel terapötik değerini öne sürüyor. Ayrıca A. muciniphila’nın Parkinson hastalığı, yaşlanma, pediatrik otizm, multipl skleroz (MS) ve Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) durumunu iyileştirdiği bildirilmiştir (Derrien vd. 2017). Bu nedenle, bu çalışmanın özel amacı, A. muciniphila tedavisinin AD benzeri semptomlar ve periodontitis ile hayvan modellerinin sağlığını iyileştirip iyileştiremeyeceğini araştırmak ve AD’yi önlemek ve tedavi etmek için yeni stratejiler için destekleyici kanıtlar sağlamak üzere, A. muciniphila’nın AD ve periodontitis arasındaki rollerinin ilişkisini incelemek amacıyla AD benzeri semptomlara ve periodontitise sahip sıçanların davranışsal ve histopatolojik indekslerini değerlendirmektir.
2. Malzemeler ve yöntemler
2.1. Bakteri türü
A. muciniphila suşu DSM 22959, Sichuan Üniversitesi, Batı Çin Halk Sağlığı Okulu’ndan profesör Guoqin Wang tarafından hediye edilmiş ve beyin-kalp infüzyon (BHI) ortamında kültürlenmiş ve anaerobik bir sisteme (Gene Science, Amerika) yerleştirilmiştir. A. muciniphila, oral inokülasyon için %2 Karboksimetilselüloz (CMC) içinde 109 koloni oluşturan birim (CFU)/ mL’ye yeniden süspanse edilmiştir.
2.2. Hayvan modeli
On üç yetişkin erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanı (250 ± 15 g), 5 haftalıkken Dashuo şirketinden satın alınmıştır. Tüm hayvan deneyleri ARRIVE kurallarına uygundu ve Sichuan Üniversitesi Batı Çin Stomatoloji Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (WCHSIRB-D-2021-009).
Sıçanlar rastgele bir kontrol grubuna (Con, n = 4) ve iki deney grubuna ayrılmıştır. Deney gruplarına 14 hafta boyunca her gün (6 W–22 W) boyunlarının arkasından deri altından AlCl3 (10 mg/kg/gün) ve D-galaktoz (120 mg/kg/gün) enjekte edilmiş, kontrol grubuna ise salin enjekte edilmiştir.
16 W’ta sıçanlara, %10 kloral hidratın intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi uygulanmıştır. Deney grupları için, bilateral üst çeneye ait ikinci azıdişi (M2) serviske 5-0 ipek suturlerle bağlanmıştır.
Daha sonra periodontitisli grup (n = 4, AD) AD benzeri semptomlar ve A. muciniphila tedavi grubu (n = 5, AKK) alan periodontitisli AD benzeri semptomlar olarak ayrılmıştır. AKK grubu için ligatür ipeğine gün aşırı 0.2 ml A. muciniphila bakteri solüsyonu sürülürken, birinci gruba ardışık 6 hafta süren %2 CMC içeren PBS sürülmüştür.
2.3. Morris Su Labirenti (MWM)
Sıçanların uzamsal öğrenme ve hafıza yetenekleri, tarif edilen protokole göre (Vorhees ve Williams, 2006) Morris Water Maze (MWM) tarafından değerlendirilmiştir. Her sıçan, dört günlük sürekli bir konumlandırma ve navigasyon deneyi almıştır. Sıçan suya bırakılmış ve sıçanın sualtındaki platforma ulaşma süresi kaçış gecikmeleri olarak ölçülmüştür. 5. günde, platform çıkartıldıktan sonra, sıçan üçüncü kadrandan serbest bırakılmış ve sıçanın ilk olarak gizli platform konumuna ulaşmak için harcadığı süre ve birinci kadranı kaç kez geçtiği not edilmiştir.
2.4. Örnek toplama
Önceki çalışmalara atıfta bulunarak (Bhuvanendran vd. 2019; Wu vd. 2019), MWM’nin bitiminden sonraki 24 saat içinde hayvan örnekleri toplanmıştır. İlk olarak, sıçanların tükürük ve dışkıları toplanmıştır. Anestezi sonrası abdominal ana damarının tüm kanı toplanmış ve serum izole edilmiştir. Daha sonra sıçanlar kurban edilmiş, beyin ve maksiller toplanmıştır.
2.5. Mikro BT değerlendirmesi
Her grubun maksillasında 10 μm çözünürlükte mikro BT taraması yapılmıştır. İlgi alanı (ROI) olarak M2’nin proksimal ve distal uçları arasındaki alveolar aralık seçilmiş ve kemik hacmi/doku hacmi (BV/TV) hesaplanmıştır. Alveolar kemik rezorpsiyon yüksekliği olarak mine-sement sınırı ile alveolar kemik kreti arasındaki dikey mesafeyi ölçmek için M2’nin bukkal ve lingual bölgelerinin mesial, orta, distali seçilmiştir.
2.6. Histoloji ve immünohistokimya
Sıçanların sağ yarım beyin dokuları parafin ile gömülmüş ve bir vibratom (Leica, Almanya) ile koronal olarak 5 μm’lik bölümlere dilimlenmiş ve sırasıyla hematoksilen ve eozin ile boyanmış, ardından reçine ile kapatılmıştır. Ayrıca parafine gömülen kesitler 99.9 ◦C’de 30 dakika antijen onarımı tarafından takip edilmiş ve ardından %3 H2O2‘de 10 dakika inkübe edilmiştir. Ve Aβ1–42’ye (ab224275, 1:200, Abcam, Cambridge, MA, ABD) karşı birincil tavşan monoklonal antikorları ile gece boyunca 4 ◦C’de inkübe edilmiş ve daha sonra biotin etiketli sekonder antikorlarla (1:300, R&D Systems) 30 dakika 37 ◦C’de inkübe edilmiştir. Pozitif boyama alanı, Hücre ve Doku Boyama Kiti (CTS005, Anti-Rabbit HRP-DAB System, R&D Systems) kullanılarak geliştirilmiştir. Görüntüler bir kamera (Nikon Eclipse 90i, Tokyo, Japonya) tarafından alınmıştır.
2.7. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
Genomik DNA; DNeasy Blood & Tissue Kit’in (Qiagen, Almanya) talimatlarına göre beyin, tükürük ve dışkıdan izole edilmiştir. DNA amplifikasyonu, önceki protokol olarak gerçekleştirilmiştir (Everard vd. 2013). Amplifikasyon için uygulanan ileri ve geri primer dizileri A. muciniphila 16S rDNA geni (Sangon Biotech Co., Ltd., Şanghay, Çin) için 5′-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC -3′ ve 5′-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT -3′ idi.
2.8. Serum testi
LPS’nin serum seviyeleri, üreticinin protokolüne göre Limulus amebosit lizat tahlili (LAL; Life Technologies, Carlsbad, CA, ABD) ile ölçülmüştür.
Bazı serumlar; AU680 kimya cihazı (Beckman Coulter, ABD) tarafından rutin biyokimyasal testler için Batı Çin Stomatoloji Hastanesi Klinik Analiz Laboratuvarına gönderilmiştir.
2.9. Mikrobiyom analizi
Dışkı DNA’sının konsantrasyonu ve saflığı, sırasıyla NanoDrop NC2000 spektrofotometre (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) ve agaroz jel elektroforezi ile ölçülmüş ve değerlendirilmiştir. Dizileme için sadece A260/A280 > 1.7 ve A260/A230 > 1.8 DNA örnekleri seçilmiştir. Toplam 10 örnek (Con, n = 3; AD, n = 3; AKK, n = 4) sıralama gereksinimlerini karşılamıştır.
Primerler (16S V3-V4, 338F:5´-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′ , 806R:5´-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) mikrobiyal 16S rRNA genlerinin amplifikasyonu için kullanılmıştır. Amplifiye edilmiş ürün; Personalbio (Shanghai, China) talimatlarına göre çift-sonlu (2 x 250 bp) okuma oluşturmak için Illumina NovaSeq platformu üzerinde sıralama için kullanılmıştır (Lu vd. 2016). Ayrıca daha önce tanımlanan süreçler olarak sıralama verileri analiz edilmiştir (Ling vd. 2014). Primer fragmanını qiime cutadapt trim-paired ile kestikten sonra, qiime dada2 denoisepaired aracılığıyla kütle kontrolü, gürültü giderme, uçbirleştirme ve tanımlama için DADA2 çağrılmıştır (Callahan vd. 2016). Ve taksonomik ek açıklamalar, tekil olanlar hariç RDP Sınıflandırıcısı (Wang ve diğerleri, 2007) tarafından her bir ASV’nin temsili dizisine atanmıştır. α ve β çeşitlilik metrikleri, numune başına 54,032 diziye seyreltilmiş numunelerle çeşitlilik eklentisi kullanılarak ölçülmüştür.
2.10. İstatistiksel analiz
Önceden işlenmiş veriler, tanımlanan protokole göre Kişisel gen bulutu platformunda daha fazla analiz edilmiştir (Angly vd. 2014; Schloss vd. 2009; McGraw vd. 2008; Zaura vd. 2009; Segata vd. 2011; Douglas vd. 2020). Diğer veriler SPSS 19.0 yazılımı kullanılarak analiz edilmiş ve ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. Gruplar arasındaki farkları değerlendirmek için tek yönlü ANOVA ve Student t-testi kullanılmıştır. P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı bir fark olarak kabul edilmiştir.
3. Sonuçlar
3.1. A. muciniphila, AlCl3 ve D-galaktoz enjeksiyonunun neden olduğu bilişsel bozukluğun şiddetini hafifletmiş ve ligatür kaynaklı periodontitisin neden olduğu kemik rezorpsiyonunu azaltabilir.
Tablo 1’de gösterildiği gibi, 4 günlük deneme süreleri boyunca kaçış gecikmesi sürekli olarak azalmış ve tüm sıçanların performansı artmıştır. Bu çalışmada AD grubunun kaçış gecikmesi, AD benzeri semptomların başarılı bir şekilde indüklendiğini gösteren 2-4 gün içinde (P <0.05) Con grubundakinden istatistiksel olarak daha uzun olduğu bulunmuştur. Özellikle, AKK grubundaki kaçış gecikmesi, 5 günlük test süresi boyunca belirgin bir düşüş eğilimi sergilemiş (Şekil 1B) ve AD grubu ile AKK grubu arasında önemli farklılıklar tespit edilebilmiştir (Tablo 1).
Su labirenti deneyinin 5. gününde hafıza yeteneğini tespit etmek için prob denemeleri yapılmıştır. Şekil 1A-B’de gösterildiği gibi, Con grubundaki sıçanların hareket aralığının esas olarak hedef kadranda (birinci kadran) veya çevresinde yoğunlaştığı; aralığın AD grubunda düzensiz veya marjinal ve AKK grubunda merkeze doğru göründüğü bulunmuştur. Uzamsal bellek testinde, tüm sıçanların batık platform konumunu ilk olarak geçmeleri için ortalama süre, gruplar arasında anlamlı farklılık sergileyen latans olarak ölçülmüştür. Con grubu ile karşılaştırıldığında, bu süre AD grubunda belirgin bir uzama göstermiş ve bu da AD benzeri semptomların yeniden başarılı bir şekilde uyarıldığını göstermiştir. Önemli olarak, AD grubu ile karşılaştırıldığında, AKK grubunda latanslarda anlamlı bir azalma gözlemlenmiştir (Şekil 1C). Ayrıca, sıçanların daha önce platformun bulunduğu konumu geçtiği ortalama sayı, AD ve AKK gruplarında Con grubuna kıyasla önemli ölçüde daha düşüktü (Şekil 1D), bu da deney sıçanlarının bariz hafıza bozukluğundan muzdarip olduğunu gösteriyor. AD grubuyla karşılaştırıldığında, A. muciniphila tedavisi alan sıçanların platformu geçme ortalama sayısı arttı, ancak önemli bir fark yoktu; bu durum, A. muciniphila’nın hayvan modellerindeki hafıza bozukluğunu daha etkili bir şekilde hafifletmekte başarısız olduğunu göstermektedir.
Ayrıca, mikro-BT değerlendirmesinin sonuçları, Con grubu ile karşılaştırıldığında, AD grubunun kemik kaybında önemli bir artışa ve başarılı periodontitis indüksiyonunu gösteren (Şekil 1F-G) hacimsel kemik kaybını ölçmek için kullanılan BV/TV’de (P < 0.05) azalmaya sahip olduğunu göstermiştir. AD grubu ile AKK grubu arasındaki karşılaştırmaya gelince, AKK grubu kemik kaybında azalma ve BV/TV’de anlamlı artış göstermiştir, ancak iki grup arasındaki önceki fark istatistiksel olarak anlamlı değildi. Bu sonuçlar, A. muciniphila tedavisinin, periodontitise sahip AD benzeri sıçanların kemik rezorpsiyonu seviyesini bir dereceye kadar azaltabileceğini göstermiştir.
Şekil 1. Sıçanlarda A. muciniphila’nın uzamsal öğrenme belleği ve alveolar kemik rezorpsiyonu üzerindeki etkisi. (A) Prob denemeleri sırasında sıçanların hareket aralığı. (B) Sıçanların yakalama aşamasında kaçış gecikmesi (*P <0.05). (C) Gruplar arasındaki tekrar ele geçirme aşamasındaki gecikme süresi (*P < 0.05). (D) gizli platformu geçme sayısı (*P < 0.05). (E) alveolar kemik rezorpsiyonunun 3 boyutlu diyagramı. (F) Hacimsel kemik kaybını ölçmek için kullanılan BV/TV’nin istatistiksel sonuçları. (G) Kemik kaybının kantitatif analizi. Sonuçlar, ortalama ± SD olarak ifade edilir ve tekrarlanan ölçümler, iki yönlü ANOVA ve tek yönlü ANOVA ve ardından Student t-testi ile istatistiksel olarak değerlendirilir. n =4–5/grup.
3.2. A. muciniphila, AD benzeri sıçanların korteks ve hipokampusundaki morfolojik değişiklikleri hafifletmiştir
A. muciniphila’nın sıçanların beyni üzerindeki etkisini araştırmak için, AD ve AKK gruplarının korteks ve hipokampuslarındaki nöronların nükleer kayıp ve büzülme ve karakteristik vakuolasyon ile hücresel atrofi sergilediğini gösteren HE boyaması yapılmıştır. Con grubundayken, korteks ve hipokampustaki nöronlar, yuvarlak hücreler ve belirgin çekirdeklerle sıkıca paketlenmişti (Şekil 2A).
İmmünohistokimyaya göre, Con grubu sıçanlarda korteks ve hipokampusta pozitif Aβ immünoreaktivitesi gözlenmezken, AD ve A.muciniphila gruplarında pozitif Aβ birikimi belirgin olarak gözlenmiştir (Şekil 2B). Şekil 2C’de gösterildiği gibi, Con grubuyla karşılaştırıldığında, AD grubundaki Aβ1-42 hücrelerinin sayısı önemli ölçüde artmıştır (P < 0.05). Bununla birlikte, AD grubuyla karşılaştırıldığında, AKK grubundaki Aβ1-42 hücrelerinin sayısı önemli ölçüde azalmış (P < 0.05), ancak Con grubuna karşı istatistiksel bir fark yoktur. Bu sonuçlar, A. muciniphila’nın, sıçan beyin dokusunun korteks ve hipokampüsündeki morfolojik değişiklikleri ve AD ile bir dereceye kadar ilişkili olan Aβ proteini birikimini azaltabileceğini düşündürmüştür.
Şekil 2. AD benzeri sıçanlarda A. muciniphila’nın nörodejenerasyon üzerindeki etkisi. (A) Sıçan hipokampüsünde (Hipp) ve kortekste (Ctx) H&E boyamasının fotomikrografları ve ölçek çubuğu 100 μm’dir. (B) Her grupta hipokampusta (Hipp) ve kortekste (Ctx) Aβ1–42’nin immünohistokimyasal boyanması, nöronların sitoplazmasında ve stromasında kahverengi-sarı madde, sıçanların hipokampüsünde ve korteksinde Aβ1–42’nin birikme yeridir (ölçek çubuğu = 20 μm). (C) Her grubun beynindeki ifade seviyeleri Aβ1–42. * P < 0.05. n = 4–5/grup.
3.3. A. muciniphila’nın kan – beyin bariyerini geçme yeteneği neredeyse çok azdı
Yukarıdaki veriler, A. muciniphila’nın hipokampusta Aβ proteini birikimini ve tau hiperfosforilasyonunu azaltabildiğini göstermiştir, ancak altta yatan mekanizma keşfedilmeyi beklemektedir. A. muciniphila’nın AD’deki rolünü araştırmak için önce A. muciniphila’nın PCR tarafından hipokampüse girip giremeyeceği incelenmiştir. Sonuçlar, türe özgü A. muciniphila 16S rDNA’nın Con grubu ve AD grubunun örnek ekstraksiyonlarında saptanmadığını göstermiştir. Ancak AKK grubundaki 5 sıçanda, bir sıçanın beyin dokusunda pozitif sonuç tespit edilebilmiştir (veriler gösterilmemiştir).
3.4. A. muciniphila periferik dolaşım metabolizması üzerinde bazı etkiler göstermiştir
A. muciniphila’nın diğer hastalıklarda bildirildiği gibi dolaşımdaki LPS’yi düzenleyerek AD ile ilişkili semptomları hafifletip hafifletemeyeceğini daha fazla doğrulamak için her gruptaki sıçanların serum LPS seviyeleri tespit edilmiştir. Sonuçlar, üç grup arasında anlamlı bir fark göstermemiştir (Şekil 3A). Biyokimyasal belirteçlerin periferik kan seviyeleri, A. muciniphila’nın periferik dolaşım metabolizması üzerindeki etkisini başlangıç olarak değerlendirmek için kullanılabilir. Con grubuyla karşılaştırıldığında, AD grubunda Trigliseritler (TG), Aspartat aminotransferaz (AST), AST/Alanin aminotransferaz (ALT) istatistiksel olarak yukarı regüle edilmiştir (P < 0.05). A. muciniphila tedavisinden sonra TG, ALT, AST ve AST/ALT’nin önemli ölçüde azaldığı (tümü P < 0.05) ve yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterolün (HDL-C) arttığı (tümü P < 0.05) bulunmuştur (Şekil 3B- G). TG, AST/ALT, A. muciniphila’nın müdahalesinden sonra regülasyona (P < 0.05) sahipti. Ürik asit (UA) ve düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol (LDL-C) de tespit edilmiş ve sonuçlar üç grup arasında bariz bir fark göstermemiştir (Şekil 3H-I). A. muciniphila’nın periferal inflamasyonun hafifletilmesi üzerinde belirgin bir etkisi olmamasına rağmen; TG, HDL-C ve AST/ALT dahil olmak üzere istatistiksel biyobelirteçler, A. muciniphila’nın periferik dolaşım metabolizması için güçlü düzenleyici etkilere sahip olduğunu ortaya koymuştur.
Şekil 3. A. muciniphila’nın periferik dolaşım metabolizmasına etkisi. (A) serum lipopolisakaritinin (LPS) kantitatif analizi; (B) trigliseritler (TG); (C) Yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol (HDL-C); (D) toplam kolesterol/HDL oranı; (E) aspartat aminotransferaz (AST); (F) alanin aminotransferaz (ALT); (G) AST/ALT oranı; (H) düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol (LDL-C); (I)UA (ürik asit); *P < 0.05; n = 4–5/grup.
3.5. A. muciniphila ile tedavi edilen sıçanlar, daha yüksek çeşitlilik ve düzgünlüğe sahip bir mikrobiyal topluluk tarafından kolonize olmuştur
A. muciniphila’nın bağırsak mikrobiyal topluluğu üzerindeki oral tedavisinin etkileri, sıçan dışkısından alınan bir 16S rRNA amplikon dizilimi kullanılarak değerlendirilmiştir. Düzenlemeden önceki ham dizilerin sayısı 1,022,232 idi ve ASV tablosunu oluşturmak için kullanılan son dizilerin sayısı 678,679’du. Ön işleme ve filtrelemeden sonra ortalama amplikon uzunluğu 428 bp idi. Yüksek kaliteli okumalar 67,877 ASV’ye atanmıştır. Farklılık testleri bu üç grup arasında önemli farklılıklar göstermiştir (PERMANOVA: F = 9.74, P < 0.001; ANOSIM: R = 0.97, P < 0.001; PERMDISP: F = 2.29, P = 0.02). PERMANOVA ve ANOSIM analizinde Con – AKK, AD – AKK grubu arasında da benzer eğilimler bulunmuştur (Tablo 2).
AKK grubunun zenginliği, gözlemlenen türlerin ortaya koyduğu gibi biraz daha yüksek bir seviye göstermiştir, ancak diğer gruplara göre istatistiksel olarak farklı değildir (P = 0.23, Şekil 4A). Ancak Pielou düzgünlük indeksleri ve Simpson indeksi, AD ve AKK arasında belirgin bir farka sahipti ve istatistiksel olarak AKK gruplarında daha yüksek seviye tespit edilmiştir (P < 0.05, Şekil 4B-C). Seyreltme analizi, dizi derinliğinin bu topluluğun çeşitliliğini geri kazanmak için neredeyse yeterli olduğunu ortaya çıkarmıştır (Şekil 4D). 10 numunenin hepsinin topluluk yapıları önce PCoA tarafından analiz edilmiştir. Şekil S1A’da gösterildiği gibi, bu üç grup iyice ayrılmıştır. Ve AKK grubundaki mikrobiyom arasındaki varyasyon derecesi, Bray-Curtis farklılığına dayalı olarak Con ve AD grubundakinden önemli ölçüde daha yüksekti (P = 0.027, Şekil S1B). Venn şekli; Con, AD ve AKK grubunda 1069, 2520, 2234 ASV olduğunu göstermiştir. Bunlar arasında, Con ve AKK grubu en fazla ASV 290 ile örtüşmüştür. 3 grup tarafından yalnızca 105 ASV paylaşılmıştır (Şekil 4E).
Şekil 4. A. muciniphila tedavisinden sonra bağırsak mikrobiyal topluluğunun özellikleri. (A) gözlemlenen türler (B) Pielou düzgünlük çeşitlilik indeksi (C) Simpson çeşitlilik indeksi ile analiz edilen mikrobiyal topluluğun Alfa çeşitliliği; D) Her gruptaki ASV sayısının seyreltme eğrileri (E) Üç gruptaki benzersiz ve paylaşılan ASV’leri gösteren Venn diyagramı. *P < 0.05.
3.6. AKK grubundaki mikrobiyom, KZYA veya nörotransmiter üreten bakterilerin artması ve patojenik bakterilerin azalması ile çarpıcı bir şekilde değişmiştir
Toplamda, 10 örnekten bilinen 32 bakteri filumu ve 70 cins tanımlanmıştır. Filum düzeyinde (Şekil 5A), en baskın filum Firmicutes (%87,5), Proteobacteria (%9,3), Actinobacteria (%2,1), Bacteroidetes (%0,4), Acidobacteria (%0,2) ve Candidatus Saccharibacteria (%0,15) idi. Bu filumlar arasında Firmicutes bolluğu artarken, özellikle diğer AD modelleriyle uyumlu olan Con’a kıyasla AD benzeri modellerde Bacteroidetes bolluğu azalmıştır. Ancak Bacteroidetes’in nispi bolluk seviyeleri, üç grup arasında önemli ölçüde farklılık göstermiştir (Şekil S2A, P = 0.038). Con grubuyla karşılaştırıldığında, AD grubunda Firmicutes’ın Bacteroidetes’e oranı önemli ölçüde artarken (1298’den 2112’e), AD grubuyla karşılaştırıldığında AKK grubunda Firmicutes’in Bacteroidetes’e oranında keskin bir düşüş göstermiştir (2112’den 95’e).
Hiyerarşik kümeleme analizine göre, AKK grubundan (D1–4) örnekler birlikte kümelenmiştir ve AD grubundan (B1-3) iyi ayrılmışlardı, bu sırada AKK grubu, AD grubuna kıyasla Con grubuna (A1-3) nispeten daha yakındı, bu da topluluklarının birbirine daha benzer olduğu anlamına geliyordu. Aerococcus gibi bazı cinsler tüm numunelerde ortak olsa da, farklı numuneler arasındaki cins dağılımındaki değişkenlik dikkat çekiciydi (Şekil 5B).
Her gruptaki bağırsak mikrobiyal topluluğunun filumdan cins düzeyine kadar yapısı ve baskın taksonları, Lineer diskriminant analiz etki büyüklüğü (LEfSe) testi ile değerlendirilmiş ve bir kladogram olarak gösterilmiştir (Şekil 5C). AD grubundan işaretli taksonlar, Şekil 5B ile uyumlu olan f_aerococcaceae, g_aerococcus, g_streptococcus’tur. Bununla birlikte, en spesifik taksonlar takip eden sırayla AKK grubundandı: Actinomycetates, Bacillates, Clostridiates ve takip eden cinsler: Staphylococcus, Gramlicatella, Caproicibacter, Saccharofermentans idi.
Cins düzeyinde, AD benzeri sıçanlarda A. muciniphila tedavisi, mikrobiyal topluluğun yapısını önemli ölçüde değiştirmiştir (Şekil 5D, Şekil S2B). Daha ileri analiz, Con grubu ile karşılaştırıldığında, AD grubunda Aerococcus ve Streptococcus’un arttığını, AKK grubunda onların bolluğunun keskin bir şekilde azaldığını ortaya çıkarmıştır (P < 0.05 AD grubuna karşı). Ayrıca AD grubunda saptanmayan Enterococcus, Staphylococcus, Jeotgalicoccus, Isobaculum ve Blautia, Con grubunda azalmış fakat AKK grubunda çarpıcı bir şekilde bir şekilde artmıştır. Başka bir deyişle, A. muciniphila tedavisi AD ile ilgili değişiklikleri tersine çevirebilir, özellikle Staphylococcus ve Blautia gibi bazı kısa zincirli yağ asitleri (SCFA) üreten bakteriler artmış ve Aerococcus ve Streptococcus gibi patojenik bakteriler açıkça azalmıştır.
Şekil 5. A. muciniphila’nın her gruptaki bağırsak mikrobiyal topluluğu üzerindeki etkisi. (A) Her grupta filum düzeyinde (ilk 10) dışkı bakterilerinin sınıflandırılması ve bolluğu. (B) Üç gruptan (ilk 20) cins düzeyinde bakteri topluluklarının taksonomik sınıflandırması ve hiyerarşik kümeleme analizi. (C) Sıçan dışkısındaki zenginleştirilmiş taksonlar kladogramlarda gösterilmiştir (ilk 20). (D) Üç gruptaki cins seviyesindeki ilk 20 bakterinin nispi bolluklarında önemli farklılıklar. *P < 0.05.
Son olarak, MetaCyc’deki metabolik yolu tahmin etmek için PICRSt2’yi kullanılmıştır. Bağırsak mikrobiyomu yüzden fazla metaboliti gizler. Bütanoat üreten yolların, AD grubuna kıyasla AKK’daki üç ayrı yolda 2 ila 5 kat arasında önemli ölçüde arttığı bulunmuştur (Şekil 6A). Ayrıca, nörotransmitter biyosentezi ve bozunması ile ilgili yollar, AD ile karşılaştırıldığında AKK ile tedavi edilen sıçanlarda bağırsak mikrobiyomunda önemli ölçüde değişmiştir (Şekil 6B). Triptofanın parçalanmasında yer alan NADSYNPWY, PWY-5655, PWY-6505 ve PWY-5651 önemli ölçüde azalırken, triptofanın biyosentezinde yer alan PWY-6629 önemli ölçüde artmıştır.
Şekil 6. MetaCyc’de butanoat metabolitlerinin metabolik yollarının tahmin edilmesi. (A) butanoat metabolik yolları; (B) triptofan metabolik yolları; log FC, log2 (kat değişimi), AD’ye karşı AKK grubu anlamına gelir.
4. Tartışma
Son zamanlarda, birkaç çalışma, bağırsak mikrobiyotası ile AD arasında, bağırsak beyin ekseninin ima edilmesiyle ilişkili olan yakın bir ilişki olduğunu bildirmiştir (Cattaneo vd. 2017). Son yıllarda en popüler probiyotiklerden biri olan A. muciniphila’nın, AD için önemli risk faktörleri olan tip 2 diyabet ve bağırsak bariyerinin işlev bozukluğu dahil olmak üzere birçok metabolik sendromla ters korelasyon gösterdiği bildirilmiştir (Grander vd. 2018; Minty vd. 2019). Bu çalışmada, A. muciniphila’nın oral inokülasyonunun Aβ peptit birikimini azaltabileceği ve onun 16S rDNA’sının az miktarda beyin numunesinde tespit edilebildiği gösterilmiştir. Ayrıca, A. muciniphila, AD benzeri modellerde artan bağırsak mikrobiyota çeşitliliği ve kompozisyon değişiklikleri ile ilişkilendirilmiştir. Böylece, A. muciniphila’nın bağırsak-beyin ekseni aracılığıyla olumlu bir rol oynamak veya soluk probiyotik bir rol oynamak için sistem dolaşımı yoluyla beyne girebileceğini düşünüyoruz.
Sıçanların bilişsel yetenekleri MWM testi ile değerlendirilmiştir. AD grubunda, Con grubuna kıyasla kaçış gecikmesi önemli ölçüde arttığı ve geçiş sürelerini azaldığı için, AD benzeri modelin başarıyla oluşturulduğu düşünülmektedir. Ayrıca, AD grubu ile karşılaştırıldığında, AKK grubunda önemli ölçüde azalmış kaçış gecikme süresi gözlemlenmiştir, A. muciniphila’nın AD benzeri sıçanların bilişsel yetenekleri üzerinde yararlı etkisi olduğu anlamına gelmektedir. Bir araştırmaya göre, 6 aylık A. muciniphila uygulanması, APP/PS1 farelerinde öğrenme ve hafıza yeteneği üzerindeki hasarı etkili bir şekilde hafifletmiştir (Ou vd. 2020). Ancak bu çalışmamızda AD ve AKK grubu arasında platform geçiş sürelerinde anlamlı bir fark yoktu. Bu bağlamda, A. muciniphila’nın 6 haftalık oral inokülasyonunun, daha belirgin davranış değişikliklerini tetiklemek için nispeten kısa olduğu sonucuna vardık. Bu nedenle, daha uzun vadeli ve daha yüksek dozda bakteri kolonizasyonunun AD’nin neden olduğu bilişsel bozukluk üzerinde daha açık bir şekilde olumlu bir etkiye sahip olabileceği olasılığını göz ardı edemeyiz.
Periodontitis indüksiyonu için, Con grubu ile karşılaştırıldığında AD grubunda anlamlı alveoler kemik kaybı ve azalmış BV/TV gözlemlenebilmiş, bu da periodontitisin başarılı bir şekilde indüksiyonunu düşündürmektedir. Daha da önemlisi, A. muciniphila kemik kaybını hafifletmiş ve ligatür kaynaklı periodontitisin neden olduğu azalan BV/TV’yi önemli ölçüde iyileştirmiştir. Başka bir çalışmada, farelere P. gingivalis ile birlikte uygulanan A. muciniphila, tek P. gingivalis uygulaması ile kıyaslandığı zaman alveoler kemik kaybını önemli ölçüde azaltabilmekte, bu da A. muciniphila’nın lokal inflamasyonu azaltabileceğini düşündürmektedir (Mulhall vd. 2020).
AD’nin ana patolojik özelliği, beyinde Aβ oluşumudur (Hill ve Lukiw, 2015) ve çalışmalar, Aβ birikiminin, özellikle periodontal enfeksiyonların neden olduğu inflamasyon ile ilişkili olabileceğini göstermiştir (Ganesh vd. 2017). Mevcut çalışmamızda, A. muciniphila ile tedavi edilen sıçanların hipokampüsünde ve korteksinde Aβ proteininin yığılımının ve birikmesinin azaldığını belirtmekte fayda vardır. Başka bir çalışma, A. muciniphila’nın 6 hafta boyunca günlük oral olarak uygulanmasından sonra, sıçanların beyninin hipokampüsünde ve korteksinde Aβ birikiminin azaldığının bulunabildiğini ortaya koymuştur (Ou vd. 2020).
Ayrıca, AD model hayvanlarda bağırsak bariyeri bozulması ve endotoksemi gözlemlenmiştir. Bakteriyel kaynaklı LPS’nin bağırsak geçirgenliğini arttırdığı, bağırsak bariyerini ve kan beyin bariyerini (KBB) geçebilen proinflamatuar faktörlerin ekspresyonunun artmasına yol açarak beyinde bağışıklık tepkisine neden olduğu bilinmektedir (Pistollato vd. 2016). Çalışmalar, P. gingivalis gibi bakteriyel patojenlerin, patojenik etkilerini aşağıdaki dört yolla gösterebileceğini bulmuştur: (1) KBB’nin geçirgenliğini arttırır ve beyne erişir; (2) LPS kan dolaşımına girerek periferal inflamasyona yol açar ve ardından virülans faktörleri (diş eti ağrıları gibi) yoluyla beyne girer (Pistollato vd. 2016); (3) normal oral mikrobiyomu bozarak inflamatuar hastalığı planlar, bu da bir topluluk rahatsızlığı durumuna (disbiyoz) yol açar (Darveau vd. 2012); (4) doğrudan ilerleyici bilişsel gerilemeye neden olur ve onun mekanizması muhtemelen mikrobiyota-bağırsak-beyin ekseni bozukluklarıyla ilişkili olabilir (Xue vd. 2020).
Sonuçlarımız, üç grup arasında serum LPS’de anlamlı bir fark olmadığını göstermiştir, bu da A. muciniphila’nın serum LPS’yi düzenleyerek pozitif rol sergilemediğini göstermiştir. Bununla birlikte, Wu ve arkadaşları A. muciniphila’nın farelere 2 hafta süreyle oral olarak uygulanmasının, Occludin ve Tjp-1 ekspresyonunu önemli ölçüde artırabileceğini, bunun da bağırsak bariyerlerini güçlendirebileceğini ve dolaşımdaki LPS’yi azaltabileceğini bildirmişlerdir (Wu vd. 2017). Ayrıca son araştırmalar AD ile HDL-C, LDL-C, toplam kolesterol (TC), TC/HDL oranı ve TG’yi içeren plazma lipidleri arasında bir ilişki olduğunu göstermiştir (Chen vd. 2019; Warren vd. 2012). Artmış plazma LDL-C, TC, TG ve azalmış HDL-C’nin artmış Aβ plakları ile ilişkili olduğu kanıtlanmıştır (Proitsi vd. 2017). Ayrıca birçok araştırmacı, HDL-C’nin Aβ plaklarının oluşumunu azaltabileceğini ve böylece inflamasyonu azaltabileceğini bulmuşlardır (den Heijer vd. 2005; Jensen vd. 2020). Bir kohort çalışması, AST’nin ALT’ye oranlarının AD tanısı ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur (Nho vd. 2019). Şuanki mevcut çalışmamızda A. muciniphila tedavisi sonrası AD grubuna kıyasla TG, TC/HDL oranı, AST/ALT oranında azalma ve HDL-C’de artış gözlenebilmiş, bu durum A. muciniphila’nın plazma lipitlerini ve periferik dolaşım metabolizmasını düzenleyerek AD ile ilişkili semptomları hafifletme olasılığını göstermektedir. Bununla birlikte, AD ile plazma kolesterolü ve çeşitli karaciğer fonksiyon belirteçleri arasındaki yakın bağlantı gösterilmiş olsa da, kesin patogenez belirsizliğini korumaktadır. Farklı çalışmalar, periferik dolaşımdaki bu biyobelirteçlerle ilgili AD patolojisi hakkında farklı teorilere sahiptir.
Çalışmamızda, A. muciniphila ile oral transplantasyondan sonra, onun 16 s rDNA’sının bireysel hayvan beyin dokularında tespit edilebileceği bulunmuştur. Artan kanıtlar, AD hastalarında zayıflamış bir KBB ve bağışıklık sisteminin mikrobiyal enfeksiyon riskinde artışa yol açtığını ortaya koymuştur (Dickie vd. 2021). Aslında sonuçlarımıza göre, A. muciniphila 16 s rDNA’sı sadece bireysel hayvan beyin dokularında tespit edilebildiğinden, A. muciniphila, onun faydalı etkisini merkezi sinir sistemi (CNS) dışındaki yolaklara etki ederek göstermeyi tercih etmiştir. Periodontitis, AD gelişimi için önemli bir risk faktörü olarak kabul edilmiştir (Kamer vd. 2015). P. gingivalis ve Treponema denticola’nın (T. denticola) AD hastalarının ölüm sonrası beyin dokularında var olduğu gösterilmiştir (Poole vd. 2013).
Bununla birlikte beyne giren A. muciniphila’nın yararlı ya da kötü etkileri olacağı daha derinlemesine çalışmalar gerektirmektedir. Çalışmamız, A. muciniphila’nın periodontitisin neden olduğu kemik rezorpsiyonunu azaltabileceğini göstermiştir; bu önceki çalışma ile tutarlıydı ve A. muciniphila’nın oral mikrobiyomu değiştirerek ve oral inflamasyonu hafifleterek AD sıçanlarının hastalığını hafifletme olasılığını göstermektedir. Bununla birlikte, AD patolojileri ile ilgili oral mikrobiyom değişiklikleri hakkındaki kesin mekanizma çok az araştırılmıştır. Bu, gelecekteki çalışmaların amacını oluşturabilir.
Birden fazla kanıt, A. muciniphila’nın transplatasyonunun, KZYA (propionik ve bütirik asit gibi) üreten bakterilerin artması ve nörotransmitterleri (dopamin ve 5-hidroksitriptamin gibi) salgılayan bakterilerin gelişmesine atfedilmesi yoluyla AD patogenezini hafifletebileceğini göstermiştir. Mevcut çalışmamızda, A. muciniphila tedavisi bağırsak mikrobiyal topluluğunun çeşitliliğini önemli ölçüde artırmıştır ve daha önce artan iltihaplanma ile ilişkili olduğu gösterilmiş olan Firmicutes/Bacteroidetes oranını azaltmıştır (Cowan vd. 2014). Ayrıca, cins düzeyinde, AD grubundaki baskın takson, AKK grubunda keskin bir şekilde azalan Aerococcus idi, idrar yolu enfeksiyonları ve peritonit gibi inflamatuar hastalıklarla ilişkilendirilebilir (Rasmussen 2016), A. muciniphila’nın AD benzeri sıçanlarda inflamatuar durumu etkili bir şekilde hafiflettiği belirtilmiştir. Ayrıca, A. muciniphila tedavisi çeşitli inflamatuar hastalıklarla ilişkili bir patojen olan Streptococcus’un bolluğunu azaltmış ve bu bakteri AD grubunda keskin bir şekilde artmıştır. Ayrıca Blautia sadece Con ve AKK grubunda mevcuttu, Blautia KZYA üreten bakterilerden biri olan ve mukozayı hasardan koruyarak, kolonosit için besin sağlayarak ve inflamasyonu hafifleterek yararlı bir rol oynayabilmektedir (Maslowski vd. 2009). AKK grubundan en spesifik cins, temsili türün bulunduğu Staphylococcus’tur, Staphylococcus epidermidis, bütirik asit üretebilmektedir (Keshari vd. 2019). Lactococcus, glutamatı inhibitör bir nörotransmitter gama-aminobutirik aside (GABA) dönüştürebilir ve onun sinyal yolundaki anormalliği, AD’nin bilişsel bozukluğu ile ilişkilidir (Wahab vd. 2019). Lactobacillus, laktik asit üretebildiği için önemli bir fonksiyonel filotip olarak tanımlanmıştır (Sedigh Ebrahim-Saraie vd. 2021).
A. muciniphila tedavisinden sonra da artan Saccharofermentans, asetik asit üreticilerinden biri olarak kabul edilmiş ve inflamatuar hastalıklarda bolluğu azalmıştır (Hahnke vd. 2016). Ayrıca, metabolik yollara ilişkin tahminimize göre A. muciniphila tedavisinden sonra bütanoat üreten yollar anlamlı bir şekilde artmıştır. Butirik asit, Aβ’nın iltihaplanmasını ve birikimini azaltmaya yardımcı olarak AD’nin patogenezini etkilediği bulunan bağırsak florasındaki anti-inflamatuar bakteriler tarafından üretilen KZYA’lerinden biridir (Macfarlane ve Macfarlane, 2012). Ho ve arkadaşları, bütirik asidin Aβ 40 monomerlerinin Aβ fibrillerine dönüşümünü doza bağlı bir şekilde engelleyebileceğini ve bütirik asit miktarının azalmasının beyinde Aβ birikimini teşvik edebileceğini bulmuşlardır (Ho vd. 2018). İlginç bir şekilde, araştırmamızda A. muciniphila tedavisinden sonra gelişmiş bütanoat üreten yollar bulunmuştur ve bu onun yararlı etkisini ortaya koyduğu olası mekanizmayı göstermektedir. A. muciniphila tedavisinden sonra önemli ölçüde artan bir başka mikrobiyal salgı nörotransmiterler, özellikle triptofandır. Triptofan metabolizması; indol, triptamin, indol asetik asit ve indol propionik asit gibi onun ürünleri nöroaktif olduğundan ve CNS aktivitesini modüle edebildiğinden, mikrobiyom-CNS iletişiminde önemli bir rol oynamıştır (Kaur vd. 2019).
Şimdiye kadar, L. pentosus var. plantarum C29 (Woo vd. 2014), Bifidobacterium breve suşu A1 (Kobayashi vd. 2017), Lactobacillus plantarum MTCC 1325 (Nimgampalle ve Kuna, 2017) gibi artan sayıda probiyotiğin AD ile ilişkili semptomları hafifletmede etkili olduğu gösterilmiştir. Hayvan modellerinde yapılan araştırmaların genel sonuçları, probiyotik bazlı tedavinin, düzenleyici genlerin ve oksidatif strese duyarlı elementlerin ekspresyonunu düzenleyerek faydalı bir rol oynayabileceğini göstermiştir. Bununla birlikte çift kör bir klinik araştırmaya göre, probiyotik takviyesi, AD hastalarının iltihaplanmasını ve oksidatif stresini iyileştirmede yeterince etkili değildi ve hastalığın şiddeti, probiyotik tedavinin yararlı etkilerinde çok önemli bir rol oynamıştır (Agahi vd. 2018). Bu nedenle, probiyotik bazlı tedavinin hastalığın şiddetini azaltabileceği ve AD hastalarının sağlığını iyileştirebileceği görüşünü desteklemek için daha derinlemesine araştırmalara ihtiyaç vardır.
5. Sonuç
Genel olarak, A. muciniphila tedavisi, periodontitisin neden olduğu alveoler kemik rezorpsiyonunu etkili bir şekilde hafifletmiş ve beyindeki Aβ plak birikimini tersine çevirerek ve periferik dolaşım metabolizmasını yöneterek bilişsel bozukluğu rahatlatmıştır. Mevcut çalışmamızda, A. muciniphila tedavisi mikrobiyal çeşitliliği iyileştirmiş, bağırsak mikrobiyotasının yapısını değiştirmiş ve bağırsak-beyin ekseni ile ilişkili olabilecek KZYA veya nörotransmiter üreten bakterileri zenginleştirmiştir. Bu bulgular, A. muciniphila tedavisinin bilişsel işlev üzerindeki iyileştirici etkisinin, kısmen oral ve bağırsak inflamasyonunun yatıştırılmasına ve beraberinde patolojik durumun gerilemesine atfedilebileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, A. muciniphila’nın spesifik hedefi hala bilinmemektedir. Ayrıca, A. muciniphila’nın nörodejenerasyonu önleyen ayrıntılı mekanizması gelecekteki çalışmalarda araştırılmalıdır ve bulgularımız, A. muciniphila takviyesinin periodontitis ve AD’nin önlenmesi ve tedavisi için yeni bir strateji olmasının beklendiği konusunda yeni bir fikir sağlayacaktır.
