Otizmli Çocukların Dışkısında Mukolitik Bakteri Akkermansia muciniphila ve Bifidobacterium spp.’nin Düşük Nispi Bollukları
Otizmli bireylerde gastrointestinal rahatsızlıklar sıklıkla rapor edilmiştir. Otizmli ve otizmsiz çocuklarda gastrointestinal sağlığı etkileyebilecek fekal bakterileri ölçmek için kantitatif gerçek zamanlı PCR analizi kullandık. Otizmli çocuklarda Bifidobacteria türlerinin ve mukolitik bakteri Akkermansia muciniphila’nın daha düşük nispi bollukları bulunmuş, bu çocuklarda diğer gösterge ise mukus bariyeri değişiklikleridir.
Otizm spektrum bozukluğu (OSB), gastrointestinal (GI) bozukluğun yaygın olarak bildirildiği karmaşık bir nörogelişimsel bozukluktur (11). OSB’li bireylerde GI mikrobiyota (8, 9, 16, 22) ve fermantasyon ürünlerinin (2, 28) profillerinin genel popülasyondan farklı olduğuna dair kanıtlar ortaya çıkmaktadır. Finegold vd. (9) gerileyen otizm ve değişmiş GI mikrobiyotası arasında bir ilişki olduğunu bildirmişlerdir. Gerçekten de, antibiyotikler (19) ve Lactobacillus plantarum WCSF1 (17) gibi probiyotiklerin kullanımı yoluyla OSB’li çocuklarda bağırsak mikrobiyotasının modülasyonunun, davranış ve bağırsak sağlığı sonuçlarını iyileştirdiği gösterilmiştir. Bu çalışmada, GI sağlığının önemli belirteçleri olarak ortaya çıkan Clostridium spp., Bacteroides fragilis grubu üyeleri, Akkermansia muciniphila ve Prevotella türleri dahil olmak üzere çeşitli GI bakterileri OSB’li çocuklarda, onların kardeşlerinde ve toplum kontrollerinde incelenmiştir. Ayrıca OSB’li çocuklarda GI mikrobiyal bollukları ve bakıcı tarafından bildirilen fonksiyonel GI bozukluklarının (FGIB’ler) varlığı veya yokluğu arasında korelasyon olup olmadığını araştırdık.
Katılımcılar için dahil edilme kriterleri önceden tanımlandığı gibidir (26). Özetle, çocukluk otizmi derecelendirme ölçeği (20) ve/veya Ruhsal Bozuklukların Tanısal ve İstatistiksel El Kitabı (DSM-IV) kullanılarak multidisipliner bir ekip tarafından teşhis edilen Otizm SA aracılığıyla kaydedilen OSB’li (n = 23) çocuklardan dışkı örnekleri toplanmıştır (3). OSB katılımcılarına otistik bozukluk (n=17) ve Asperger sendromu (n=6) teşhisi konmuş ve üç katılımcı dışında hepsinin gerileyen bir otizm formuna sahip olduğu bildirilmiştir. OSB kriterlerini karşılayan ancak bir kromozomal anormallik komorbid teşhisisi ile başvuran çocuklar çalışma dışı bırakılmıştır. Ayrıca, OSB kohortunun tipik olarak gelişen 22 kardeşini (SIB) ve ailede otizm öyküsü olmayan 9 ilgisiz topluluk kontrolünü (CON) iki farklı kontrol grubu olarak kaydettik. CON katılımcıları, OSB’li bir kardeşleri veya ilk kuzenleri yoksa katılım için uygundular. Katılımcıların bakıcılarından bir fonksiyonel gastrointestinal bozukluk (FGID) anketi (21) ve ilaç kullanımını araştıran bir anket doldurmaları istenmiştir.
Günlük değişkenliği hariç tutmak için 48 saatlik bir süre boyunca katılımcılardan taze dışkı örnekleri toplanmıştır. Her bağırsak hareketi ayrı bir torbada toplanmış ve hemen portatif bir dondurucuda dondurulmuş ve -20°C’de depolanmıştır. Numuneler dondurucularda laboratuvara taşınmış ve işlenene kadar -80°C’de saklanmıştır. Örnekler oda sıcaklığında çözülmüş ve tüm işlemler anaerobik koşullar altında gerçekleştirilmiştir (Bactron IV anaerobik oda; Sheldon). Her dışkı örneğinin kütlesi, bireysel katılımcıların 48 saatlik örnekleme periyodunda toplanan diğer dışkı örnekleriyle birleştirilmeden önce kaydedilmiştir. Dışkı örnekleri homojenleştirilmiş ve DNA ekstraksiyonu ve analizi için dışkı alikuotları alınmıştır.
DNA, 0.25 g dışkı maddesinden bir tekrarlı boncuk dövme artı kolon yöntemi kullanılarak ekstrakte edilmiştir (29). Kullanılan primerler ve optimize edilmiş kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) koşulları, ek materyaldeki Tablo S1’de özetlenmiştir. Tüm qPCR analizleri, bir CFX 384TM gerçek zamanlı PCR saptama sisteminde (Bio-Rad, Hercules, CA) üç tekrar halinde ve toplam 10 μl hacimde gerçekleştirilmiştir. Her reaksiyon karışımı, 4 µl (1 ng/µl) DNA şablonu ve 5 µl SsoFast EvaGreen Supermix, 0,5 µl sığır serum albümini, ileri ve geri primerler ve PCR dereceli su içeren 6 µl PCR karışımından (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) oluşur. qPCR döngü koşulları aşağıdaki gibidir: 3 dakika boyunca 98°C’de sıcak başlangıç, ardından ek materyaldeki Tablo S1’de gösterildiği gibi tavlama/uzama süreleri ve sıcaklıkları kullanılarak 98°C’de 15 saniye denatüre edilmiş 35 döngü iki aşamalı qPCR. Bunu, her döngüden sonra floresan edinimi izlemiştir. Amplifikasyonun özgüllüğünü doğrulamak için 55 ve 95°C arasında 0.5°C aralıklarla elde edilen floresan ile tüm döngülerin tamamlanmasından sonra nihai bir erime eğrisi analizi gerçekleştirilmiştir. Hedef amplikon içeren bir plazmit yapısının sekiz adet 10-kat seyreltme serisi mutlak bolluk ve PCR etkinliğinin tahmini için DNA örneklerine paralel olarak analiz edilmiştir. Veriler, mutlak miktarlar için Bio-Rad CFX Manager yazılımı (versiyon 1.5) ile analiz edilmiştir (ek materyalde Tablo S2’ye bakınız). Bakteri gruplarının nispi bollukları qbase + (Biogazelle, Ghent, Belçika) ile analiz edilmiştir (10, 23). Veriler, istatistiksel analizler yapılmadan önce Windows için SPSS (sürüm 17; SPSS Inc., Chicago, IL) kullanılarak log10 dönüşümü ile normalleştirilmiştir. 0.05’ten küçük bir P değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.
Katılımcıların özelliklerinin analizi, OSB’li çocuklarda CON katılımcılarından daha yüksek bir FGID insidansı gösterirken SIB katılımcılarındaki FGID’lerin insidansı OSB ve CON katılımcıları arasında orta düzeydeydi (Tablo 1). OSB’li 23 çocuktan dokuzunda GI sorunları bulunmaktaydı ve bunlardan dördünde hem kabızlık hem de ishal, dördünde sadece kabızlık ve bir tanesinde yalnızca ishal vardı. Kardeşlerden birinde hem kabızlık hem de ishal, birinde yalnızca ishal, dördünde ise yalnızca kabızlık vardı. Topluluk kontrol grubundaki çocuklardan biri kabızlık yaşıyordu.
aOSB, otizm spektrum bozukluğu; SIB, tipik olarak gelişen kardeş; CON, bağımsız kontrol; FGID’ler, fonksiyonel gastrointestinal bozukluklar.
OSB katılımcılarında CON (P = 0.006) ve SIB (P = 0.032) katılımcılarına göre Bifidobacterium spp.’nin daha düşük nisbi bolluğu gözlenmiştir. OSB katılımcılarında CON katılımcılarına göre A. muciniphila bolluğu düşük bulunmuş (P = 0.029) ve A. muciniphila SIB katılımcılarında da CON katılımcılarına göre daha düşüktü (P = 0.031). Ayrıca, fonksiyonel gastrointestinal bozukluklara (FGID) sahip OSB’li çocuklar FGID’leri olmayanlarla kıyaslandığında B. fragilis grubunun nispi sayıları yüksekti (P = 0.019). Başka hiçbir bakteriyel hedef çalışma grupları arasında bol miktarda farklılık göstermemiştir (Tablo 2).
Tablo 2. Hedef bakterinin nispi bolluğua
a qbase + kullanılarak nisbi bolluklar hesaplanmıştır (10, 23).
b SRB, sülfat indirgeyen bakteriler; aps, adenosin-5′- fosfosülfat redüktaz geni; dsr, disimilatuar sülfit redüktaz geninin (dsrA) alt birimi.
c Aynı satırdaki verilerin yanındaki A veya B Üst Simgesi, katılımcı grupları arasında önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir (P < 0.05).
Çalışmamızdaki kontrollere (SIB ve CON) göre OSB katılımcılarında Bifidobacterium spp.’nin daha düşük nispi bolluğu, Adams vd.’nin (1) son bulguları ile tutarlıdır. Buna karşılık, başka bir çalışmada OSB olan ve olmayan çocuklarda bifidobacterium spp.’nin benzer seviyeleri rapor edilmiştir. İkinci çalışmadaki OSB katılımcıları, çalışmaya girmeden önce GI mikrobiyotasının bileşimini etkilemiş olabilecek birkaç kür antibiyotik (%90) ve/veya probiyotik (%53) almışlardır. Özellikle, OSB katılımcılarımızdan sadece biri örnekleme döneminden önceki hafta sırasında antibiyotik almıştır. Ayrıca, SIB veya CON katılımcılarının hiçbiri örnekleme periyodundan hemen önce veya sırasında antibiyotik almamıştır. Ayrıca, OSB katılımcılarımızdan ikisi numune toplama döneminde probiyotik alıyordu. Bifidobacterium spp., antibiyotikler, probiyotikler ve OSB arasındaki ilişkinin daha fazla araştırılması gerekmektedir. Bifidobacterium spp.’nin doğru türlerinin kullanılması önemli olacaktır; örneğin, Bifidobacterium longum Ncc3001’in farelerde vagal sinir yoluyla anksiyeteyi iyileştirdiği gösterilmiştir (15).
A.muciniphila, sağlıklı yetişkinlerin bağırsaklarında bol miktarda bulunan müsin parçalayıcı bir bakteridir, ancak Crohn hastalığı veya ülseratif koliti olan hastalarda ve yaşlılarda sayıları azalır (4, 14, 18). Bu, A. muciniphila’nın bağırsak sağlığı için önemli bir belirteç olabileceğini gösterir. Ülseratif koliti olan hastalarda kontrollere göre (5) sıklıkla daha ince bir mukus tabakası bulunur, bu muhtemelen müsin parçalayıcı bakteriler için daha az substratı temsil eder ve dolayısıyla dışkıda daha düşük sayılardadırlar. Böylece, OSB’li çocuklarda ve kardeşlerinde daha düşük A. muciniphila bolluğu bulmamız, OSB’li çocuklarda CON katılımcılarına göre daha ince bir GI mukus bariyerini gösterebilmektedir. Bu sonuçlar OSB’li çocuklarda bozulmuş bağırsak geçirgenliğinin dolaylı kanıtını temsil edebilir (6, 7). Daha önceki bir çalışma (6) OSB’li çocuklarda ve onların birinci derece akrabalarında bağırsak geçirgenliğinin arttığını göstermiştir. Hem OSB’li çocuklarda hem de kardeşlerinde A. muciniphila’daki azalma bulgumuz bu hipotezi desteklemektedir. A. muciniphila’nın daha düşük nispi bolluğunun değişmiş mukus döngüsünü temsil edebileceğini öne sürmüş olsak da, bunun gerçekten yararlı mı veya zararlı bir farkı mı temsil ettiğini belirlemek için yeterli bilgiye sahip değiliz. Bu çalışmada ölçülmeyen diğer bakteriler de mukusu parçalayabilir ve ayrıca potansiyel olarak değişmiş mukus bariyer fonksiyonuna ve/veya A. muciniphila seviyelerinin bozulmasına katkıda bulunabilir. Bu nedenle, gelecekteki çalışmalarda OSB’li çocukların dışkısında daha geniş bir aralıktaki mukus-parçalayıcı bakteri sayılarının analizi bilgilendirici olacaktır.
B. fragilis grubu içindeki türler, konakçı sağlığı üzerinde faydalı etkilere sahiptir oysa diğerleri önemli morbidite ve mortaliteye sahip enfeksiyonlara neden olmaktadır (27). Rapor edilen FGID’leri olan OSB’li çocuklarda daha yüksek sayıda B. fragilis grubu bulunduğundan, otizmli çocuklarda B. fragilis grubuna ait bazı türlerin GI patolojisinden sorumlu olması olasıdır. B. fragilis grubunun belirli üyelerini hedef alan gelecekteki analizler, ilgili türlere daha fazla ışık tutacaktır.
Önceki çalışmalardan elde edilen sonuçların (16, 22) aksine, bu çalışmada tüm katılımcılarda Clostridium küme I’den benzer bakteri seviyeleri bulunmuştur. Parracho vd. (16) tarafından OSB’li çocuklarda Clostridium histolyticum grubunun (Clostridium küme I artı küme II) üyelerinin daha yüksek bolluğu rapor edilmiştir. Bununla birlikte, araştırmalarındaki katılımcıların çoğunda (%76) ishal vardı ve katılımcıların %66’sı glütensiz ve/veya kazeinsiz diyet uyguluyorlardı. Ayrıca Parracho vd.’nin sonuçları her katılımcıdan tek bir dışkı örneğine dayanıyordu. GI mikrobiyal popülasyonunun daha iyi bir temsilini sağlayan ve günlük varyasyonları ortadan kaldıran 48 saatlik bir süre boyunca örnekleri topladık. Kohortumuzdaki OSB’de en yaygın FGID semptomu kabızlıktı ve sadece dört çocuk glütensiz ve/veya kazeinsiz bir diyet uyguluyordu. Song vd. (22) tarafından yapılan çalışmada, OSB’li çocukların dışkı örneklerinde kontrollere göre önemli ölçüde daha yüksek sayıda Clostridium küme I ve Clostridium bolteae bakterisi gösterilmiştir, fakat yazarlar her ikisi de mevcut çalışma ile farklılık gösteren noktaları anlamak için gerekli olan katılımcılar veya örnek toplama metodolojisi hakkında yalnızca sınırlı bilgi sağlamışlardır. Bu nedenle, Clostridium türlerinin bolluğu ile ilgili farklı bulgular, çalışma kohortlarında FGID’lerin çeşitli gösterimleri ve çeşitli diyet müdahaleleri ile ilgili olabilir. Ayrıca, birincil bütirat üreticilerinin çoğunu kapsayan ve bağırsak sağlığı için faydalı olan Faecalibacterium prausnitzii, Clostridium leptum grubunun üyeleri ve Clostridium coccoides grubunun üyeleri gibi hedeflenen bakteri sayıları çalışma grupları arasında önemli ölçüde farklılık göstermemiştir.
MacFabe vd. tarafından sıçanlarda yapılan önceki çalışmalar, propiyonatın intraventriküler uygulamasının otizme benzer davranışlara (örn., tekrarlayan distonik davranışlar, retropulsiyon, nöbetler ve sosyal kaçınma) neden olduğunu göstermiştir (12, 13). Aynı dışkı örneklerinde kontrollerle karşılaştırıldığında OSB’li çocuklarda dışkı propiyonat konsantrasyonlarının arttığını da bildirdik (25). Bununla birlikte, önemli bir propiyonat üreten bakteri olan Prevotella sp.’nin bolluğu, çalışma grupları arasında önemli ölçüde farklı değildi. Bu, başlıca propiyonat üreticilerini de (24) içeren Clostridium küme IX’den olanlar gibi hedeflenmemiş diğer bakterilerin, dışkı propiyonat konsantrasyonlarında gözlenen farklılıklardan sorumlu olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, bakteri sayısından ziyade propiyonat üretmekten sorumlu bakterilerin aktivitelerinin değiştirilmiş olması mümkündür. OSB’li çocuklarda GI geçiş süresini değiştiren GI işlevindeki farklılıklar gibi diğer faktörler de dikkate alınmalıdır.
Özetle, tükenmiş A. muciniphila ve Bifidobacterium spp. popülasyonlarının mevcut bulguları, OSB’li çocukların GI kanallarındaki değişiklikler hakkındaki bilgimize katkıda bulunmaktadır. Bu bulgular, OSB’li bireylerde bağırsak mikrobiyotasını etkileyen ve GI sağlığını iyileştiren diyet/probiyotik müdahalelerin uygulanmasına potansiyel olarak rehberlik edebilir.
