Akkermansia muciniphila’nın dış zar proteini Amuc_1100, TLR2 sinyal yoluyla bağırsak 5-HT biyosentezini ve hücredışı kullanılabilirliği destekler

Akkermansia muciniphila, konakçı bağırsak mukus tabakalarında yaşayan bir probiyotiktir ve konakçı enteriti, obezite ve diyabet gibi metabolik bozukluklar üzerinde belirgin hafifletici veya tedavi edici etkiler göstermektedir. A. muciniphila’nın dış zar proteini Amuc_1100’ün konakçı ile etkileşim sırasında hayati bir rol oynaması muhtemeldir. 5-HT, çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde yer alan gastrointestinal sistem fonksiyonlarını ve diğer organları düzenleyen bir nörotransmitter ve anahtar bir sinyal molekülüdür. Bu çalışma Amuc_1100’ün; RIN-14B hücrelerinde 5-HT sentez hızı sınırlayıcı enzim Tph1’in ekspresyonunu destekleyebileceğini ve TLR2 ile doğrudan etkileşim yoluyla Caco-2 hücrelerinde serotonin geri alım taşıyıcısının (SERT) ekspresyonunu azaltabileceğini böylece 5-HT biyosentezini ve hücre dışı kullanılabilirliği iyileştirebileceğini göstermiştir. Hayvan modelleri olarak antibiyotik uygulanan fareleri kullanarak, A. muciniphila veya Amuc_1100 ile gavajdan sonra kolon dokularında Tph1 ekspresyonunun arttığını ve SERT ekspresyonunun azaldığını bulduk. Kolon dokuları ve kandaki 5-HT konsantrasyonları aynı anda belirgin şekilde yükselmiştir. Ayrıca, A. muciniphila veya Amuc_1100’ün; antibiyotik uygulanan farelerde gastrointestinal hareketlilik fonksiyonunu iyileştirdiğini ve bağırsak mikrobiyota bolluğunu ve tür çeşitliliğini restore ettiğini bulduk. Bu sonuçlar A. muciniphila’nın, dış zar proteini Amuc_1100 ve TLR2 aracılığıyla konakçı bağırsak 5-HT sistemini düzenleyebileceğini göstermektedir. Bu mekanizma, A. muciniphila’nın konakçı ile etkileşime girmesi ve ayrıca 5-HT ile ilgili fizyolojik fonksiyonları etkilemesi sayesinde önemli bir yaklaşımı temsil etmektedir. Bu sonuçlar, ilgili hastalıklar için yeni müdahale stratejilerinin temeli olabilecek, bağırsak mikrobiyotası ile konakçı arasındaki etkileşim mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirir. 

1. Giriş

Bağırsak mikrobiyotası konakçının bağışıklık, endokrin, sinir sistemi ve diğer metabolik yolları ile etkileşime girerek insan sağlığını etkileyebilmektedir. Bağırsak mikrobiyotası lokal bariyer fonksiyonu için homeostazı sürdürmenin yanı sıra; enerji metabolizması, kardiyovasküler uygunluk, kronik inflamasyon, otoimmünite, tümör oluşumu ve kanser dahil olmak üzere birçok fizyolojik aktiviteyi ve patolojik durumu etkilemektedir.^1–3 Akkermansia muciniphila, Verrucomicrobia filumuna ait Gram negatif, zorunlu anaerobik bir bakteridir.

A. muciniphila, ana metabolik özelliği olarak bağırsak musinini parçalayarak insan ve hayvan bağırsak mukus tabakalarında yaşamaktadır.^4–9 A. muciniphila enterositlere yapışabilmekte ve bağırsak bariyer fonksiyonunu iyileştirebilmektedir.¹⁰ Çok sayıda çalışma; A. muciniphila bolluğu ile konakçı enterit, obezite ve de diyabet gibi metabolik hastalıklar arasında bariz bir şekilde ters ilişki göstermiştir.^11–14 Otizmli çocukların bağırsak mikrobiyomunda A. muciniphila nispeten düşük bollukta bulunmuştur.¹⁵ Kanserli hastaların bağırsak mikrobiyota bileşiminde A. muciniphila’nın nispi bolluğu daha büyük klinik yanıtlar ve immünoterapinin tedavi etkinliği ile pozitif ilişkiliydi.¹⁶ Ayrıca A. muciniphila bağırsak mikrobiyota kompozisyonunu ve zenginliğini de etkileyebilmektedir. Kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında, A. muciniphila verilen fareler farklı bağırsak mikrobiyota çeşitlilik profilleri ve miktarlarına sahipti, bu durum konakçılarda inflamatuar sitokinlerde ve sitotoksinde azalmaya ve bunun sonucunda bağışıklık aracılı karaciğer hasarına karşı korumaya yol açabilmektedir.¹⁷ A. muciniphila’nın dış zar proteinleri, A. muciniphila-konakçı etkileşiminde ve bağırsak mukozası kolonizasyonu ve materyal geçişi süreçleri sırasında önemli ve doğrudan roller oynamaktadır. Bunlar arasında dış zar proteini Amuc_1100, konakçının bağışıklık homeostazını ve bağırsak mukozasını korumada ve bağırsak bariyeri fonksiyonunu iyileştirmede kritik bir rol oynaması muhtemel olan TLR2 sinyal yolu aracılığıyla spesifik sitokin IL-10’un üretimini indükleyebilmektedir.^18,19 Rekombinant olarak eksprese edilen Amuc_1100 proteini termostabildi ve vücut ağırlığını azaltmak ve farelerde glukoz intoleransını ve insülin direncini iyileştirmek için A. muciniphila gibi aynı etkilere sahipti.¹³ A. muciniphila ve onun dış zar proteini Amuc_1100, hastalarda inflamatuar bağırsak hastalığını (IBD) hafifletebilmekte ve CD8+T hücreleri aracılığıyla deney hayvanlarında kolit ve ilgili kanser insidansını azaltabilmektedir.²⁰ Bu nedenle, A. muciniphila ve dış membran proteinlerinin konakçılarla etkileşime girdiği moleküler mekanizmalar ve etkili yollar üzerinde yapılacak çalışmalar, A. muciniphila’nın bağışıklık ve metabolik bozuklukları iyileştirdiği iç mekanizmalar hakkında bilgi verecek ve A. muciniphila’nın varlığından etkilenebilecek diğer fizyolojik işlevleri veya konakçı hastalıklarını araştıracaktır.

Serotonin olarak da bilinen 5-Hidroksitriptamin (5-HT), çok işlevli bir biyojenik indolamindir. Dahili 5-HT’nin %90’ından fazlası, bağırsak mukus katmanlarındaki enterokromaffin hücrelerinden (EC hücreleri) gelmektedir. EC hücreleri; asetilkolin aktiviteleri, sempatik sinir sistemi stimülasyonu, intraluminal basınç değişiklikleri ve pH düşüşü gibi faktörler tarafından 5-HT salınımını teşvik edebilir.²¹ EC hücreleri tarafından bağırsak 5-HT biyosentezi iki adımdan meydana gelir. İlk olarak, triptofan hidroksilaz 1 (Tph1, 5-HT sentezinin hız sınırlayıcı bir enzimi) triptofanı 5-hidroksitriptofana (5-HTP) dönüştürür. İkinci olarak, aromatik L-amino asit dekarboksilaz, ekzositoz yoluyla salgılanan 5-HT’yi üretmek için 5-HTP’nin dekarboksilasyon reaksiyonunu katalize eder ve farklı tepkileri tetiklemek için spesifik 5-HT reseptörlerini etkinleştirir böylece çeşitli fizyolojik fonksiyonları modüle etmektedir. 5-HT’nin hücre dışı kullanılabilirliği ayrıca bağırsak epitel hücrelerinin apikal yüzeylerinde ve bazolateral membranlarda bulunan serotonin geri alım taşıyıcısı (SERT) tarafından düzenlenir. SERT, bağırsak epitel hücrelerine tutulmasıyla interstisyel alandan 5-HT’yi kaldırabilir ve böylece 5-HT sinyalini sonlayabilir. 5-HT, sinir sistemi için anahtar bir nörotransmiter ve gastrointestinal motilite ve inflamatuar yanıtların fizyolojik işlevleri dahil olmak üzere gastrointestinal sistem ve diğer organların performanslarını modüle etmek için kritik bir sinyal molekülüdür.^22,23 Bağırsak 5-HT içeriğindeki değişiklikler, bir dizi inflamatuar bağırsak hastalığına ve huzursuz bağırsak sendromlarına neden olabilir. Kana salınan 5-HT; trombosit agregasyonu, vazodilatasyon ve kemik gelişimi gibi fizyolojik süreçleri düzenleyebilir.²¹ Aynı zamanda 5-HT hepatositler ve adipositler üzerinde de etki edebilir ve glukoz homeostazının ve yağ metabolizmasının düzenlenmesinde rol oynar, yani obezite ve tip 2 diyabet (T2D) gibi metabolik bozukluklarla yakından ilişkilidir.²⁴ 

Bağırsak mikrobiyotası konakçılarda 5-HT seviyelerini etkileyebilir, ayrıca 5-HT ile ilgili çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçleri de etkiler. Mikropsuz farelerden (GF fareler) alınan numuneler yaygın olarak kullanılan farelerden alınan plazma ekstraktlarıyla karşılaştırıldığında, 5-HT içeriğinin önemli ölçüde azaldığı görülen çoklu kan metabolitlerinin seviyelerinde değişiklikler göstermiştir;²⁵ bağırsak mikrobiyotası ile yeniden kolonizasyon, GF farelerinde bağırsak luminal 5-HT seviyelerini önemli ölçüde artırabilmektedir.²⁶ Antibiyotik uygulanan fareler, bağırsak mikrobiyotasının zenginliği ve çeşitliliğinde azalma ve gastrointestinal hareketlilikte gecikme göstermiştir.  Aynı zamanda azalan bağırsak 5-HT ve Tph1 seviyeleri, bağırsak mikrobiyomu ve bağırsak fonksiyonu arasındaki ilişkide 5-HT metabolizmasının önemini ortaya çıkarmıştır.²⁷ Ayrıca Reigstad vd. tarafından yapılan araştırma bağırsak mikrobiyotasının, Tph1 ekspresyonunu artırabildiğini ve bağırsak EC hücreleri tarafından 5-HT biyosentezini iyileştirebildiğini, böylece gastrointestinal hareketliliği etkileyebildiğini göstermiştir. Ayrıca Tph1 ekspresyonunun, bağırsak mikrobiyomundan metabolit kısa zincirli yağ asitleri (butirat veya asetat gibi KZYA’lar) tarafından indüklendiği tahmin edilmiştir.²⁸ Yano vd.’den elde edilen deneysel sonuçlar, fare ve insan bağırsak mikrobiyotasından spor oluşturan bakterilerin EC hücreleri tarafından kolon 5-HT biyosentezini destekleyebileceğini ve bağırsak mukozası, lümen ve kan dolaşım sistemindeki 5-HT konsantrasyonlarını artırabileceğini böylece konakçı fizyolojisini (gastrointestinal motilite ve trombosit agregasyon fonksiyonları gibi) önemli ölçüde etkileyebileceğini göstermiştir. Spor oluşturan bakterilerden üretilen bazı çözünür metabolitler muhtemelen sinyalleme etkilerini kullanmışlardır.²⁹ Bağırsakta yükselen 5-HT seviyeleri, sırayla bağırsak mikrobiyota topluluk yapısını ve metabolizmasını etkileyebilmektedir. 5-HT, bağırsak mikrobiyomunun büyümesini doğrudan veya dolaylı olarak etkileyebilmekte ve sonuç olarak konakçının kolite duyarlılığını ve inflamasyonun şiddetini etkileyebilmektedir.^30,31 Son araştırmalar, bağırsak bakterisi Turicibacter sanguinis’in insan SERT’sine homolog bir protein eksprese ettiğini bulmuştur. Bu bakteri, konakçı bağırsak lümeninde 5-HT’yi absorbe edebilmekte ve bağırsak mikrobiyota arasındaki kolonizasyonunu artırarak konakçı steroid ve lipit metabolizmasını daha da etkileyebilmektedir.^32,33 Bu nedenle, bağırsak 5-HT sistemi bağırsak mikrobiyotasının konakçı fizyolojisini etkilemesi için etkili bir yolu temsil eden çift yönlü konakçı-mikroorganizma etkileşimlerini köprülemek için önemli bir merkezdir.

Toll-benzeri reseptörler (TLR’ler), doğuştan bağışıklık tepkilerinin ana düzenleyicileridir ve mikroplar için tanıma reseptörleri olarak işlev görmektedir. TLR’ler bağırsak homeostazının korunmasına katkıda bulunmakta ve inflamatuar bağırsak yaralanmalarını hafifletmeye yardımcı olmaktadır. Araştırmalar, TLR2’nin bağırsak 5-HT seviyelerini modüle ederek bağırsak patofizyolojisini etkileyebileceğini ortaya koymuştur. TLR2 aktivasyonunun, Caco-2/TC7 (bir insan enterosit benzeri hücre hattı modeli) hücrelerinde 5-HT taşıyıcı SERT proteinini inhibe ederek taşıma aktivitelerini baskılayabileceği tespit edilmiş; TLR2 tarafından bağırsak SERT’sinin inhibisyonunu doğrulayan TLR2 nakavt farelerde SERT’nin bağırsak ekspresyonunun arttığı görülmüştür.³⁴ SERT ekspresyonunu azaltarak, Listeria monocytogenes hücre içi 5-HT alımını inhibe edebilir ve bağırsak lümeninde 5-HT miktarını artırabilir; TLR10, SERT aktivitesinin inhibe edici mekanizmasına dahil olmuş olabilir.³⁵ Wang vd. tarafından bildirilen araştırmaya göre antibiyotik uygulanan fareler, EC hücre sayısında ve farelerde TLR2 ekspresyonunun aşağı regülasyonu ile ilişkili olan 5-HT biyosentezinde bariz bir düşüş sergilemiştir. TLR2 sinyal yolunun eksikliği, farelerde dahili 5-HT biyosentezini etkilemiştir, bu da TLR2 aracılı sinyallemenin bağırsakta 5-HT metabolizmasını modüle etmede çok önemli bir rol oynadığını göstermektedir.³⁶

Bağırsak mikrobiyotasının 5-HT biyosentezi üzerinde büyük bir etkisi olduğundan ve TLR2 doğrudan bağırsak mikrobiyota uyarısını alabildiğinden; bağırsak mikrobiyotası, konakçı TLR2 ve 5-HT arasında yakın bir ilişki olabilmektedir. Bağırsak mukus tabakalarında bulunan A. muciniphila; konakçı bağırsak iltihabını, obezite ve diyabet gibi metabolik bozuklukları önemli ölçüde iyileştirebilmekte; olası bir mekanizma TLR2 vasıtasıyla onun işlevini uygulayan dış zar proteini Amuc_1100 tarafından aracılık edilebilmektedir. Araştırmalarımız, TLR2 molekülü ile doğrudan etkileşim yoluyla Amuc_1100’ün 5-HT sentez hızı sınırlayıcı enzim Tph1’in ekspresyonunu destekleyebileceğini ve tersine 5-HT taşıyıcı protein SERT’nin ekspresyonunu engelleyebileceğini böylece konakçı bağırsak 5-HT seviyelerindeki değişiklikleri modüle edebileceğini göstermiştir. Bu arada, A. muciniphila’nın etkilerini özetleyen Amuc_1100, antibiyotik uygulanan farelerde bağırsak hareketliliğini iyileştirebilmekte ve bağırsak mikrobiyotasının miktarını ve türünü restore edebilmektedir. Bu, A. muciniphila ve konakçının birbirleriyle etkileşime girdiği özel mekanizmaları açıklığa kavuşturur ve A. muciniphila ve Amuc_1100’ün konakçı bağırsak fonksiyonunu, iltihabı ve metabolik bozuklukları iyileştirdiği faaliyet yollarını açıklar. Bu çalışma, A. muciniphila’nın konakçılarla etkileşime girdiği moleküler mekanizmayı ve yolları ortaya koymakta ve o, bağırsakları hedef alan ve ilgili insan hastalıkları için tedavi edici ilaçlar geliştiren yeni tedavi yaklaşımları için temel sağlamaktadır.

2.1. A. muciniphila ve Amuc_1100’ün hazırlanması

A. muciniphila (ATCC BAA-835), 37 °C’de 48 saat süreyle anaerobik bir haznede (%100 N₂) %0.05 sistein-HCl içeren bir beyin kalp infüzyon sıvısında kültürlenmiştir. Anaerobik koşullar altında %5 defibrine koyun kanı ve %0.05 sistein-HCl içeren triptik soya kullanılarak plaka sayımı ile CFU mL^-1‘i belirlemek için temsili bir kültür stoğu kullanılmıştır. Bu kültür, 200 μl başına 1.5 x 10⁹ CFU’luk bir nihai konsantrasyona anaerobik PBS ile seyreltilmiş ve -80 °C’de depolanmıştır. Amuc_1100, daha önce bildirilen metoda göre hazırlanmıştır.³⁷ Kısaca, rekombinant protein E. coli BL21 (DE3) içinde eksprese edilmiş ve bir elüsyon tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl) ile Ni-NTA tarafından saflaştırılmıştır. His-etiketi TEV enzimi tarafından çıkarılmış ve fazla TEV ve His-etiketi proteini Ni-NTA tarafından ayrılmıştır. Daha sonra etiketsiz Amuc_1100, fosfat tamponlu salin (PBS) (pH 7.2) içeren bir tampon içinde bir HiLoad 16/60 Superdex 200 kolonu (GE Healthcare) üzerinde jel filtrasyonu ile saflaştırılmıştır.

2.2. Hayvan deneyleri

Erkek C57BL/6 fareleri (6-8 haftalık; 20 ± 2 g) sterilize edilmiş, üstü filtreli kafeslere yerleştirilmiştir, 21–22 °C sıcaklıkta ve bir SPF odasında 12/12 saat aydınlık/karanlık döngüsüyle otoklavlanmış normal  yem ile beslenmiştir. Bir haftalık ortama alıştırmadan sonra bağırsak sterilizasyonu için farelere, içme suyuna üç hafta boyunca aşağıdaki konsantrasyonlarda antibiyotikler uygulanmıştır: ampisilin, 1 g L^-1; neomisin sülfat, 1 g L^-1; metronidazol, 1 g L^-1; ve vankomisin, 500 mg L^-1. A. muciniphila ve Amuc_1100’ün bağırsak 5-HT üzerindeki etkisini araştırmak için, antibiyotik uygulanan fareler, 200 μl hacimli steril PBS içinde 100 μg Amuc_1100 veya 1.5 x 10⁹ CFU A. muciniphila ile günlük olarak beslenmiştir. İki hafta sonra, fareler servikal dislokasyon ile kurban edilmiştir ve ileri analiz için serum, kolon ve dışkı örnekleri toplanmıştır. Tüm hayvan prosedürleri, Çin Anhui Üniversitesi’nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakım ve Kullanım Kılavuzuna uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Çin Anhui Üniversitesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. 

2.3. Hücre kültürü ve uygulamaları

RIN-14B hücre hattı, bu hücreler bir sıçan pankreas adacık tümöründen türetildiği için seçilmiştir ve EC hücreleri için bir model olarak kullanılmıştır.³⁸ RIN-14B hücreleri, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve 100 U ml^-1 penisilin ve 100 μg ml^-1 streptomisin ile desteklenmiş RPMI-1640’ta kültürlenmiştir. RIN-14B hücreleri, 12 oyuklu bir plaka içinde oyuk başına cm² başına 6 x 10⁵ hücrede ekilmiş ve 37 °C’de 48 saat boyunca inkübe edilmiştir. Kültürlenmiş RIN-14B hücreleri, 24 saat boyunca bir TLR2 agonisti, Pam3CSK4 (5 μg ml^-1) ve Amuc_1100 (20 μg ml^-1) ile işlem görmüştür. TLR2’nin sinyal yolunu incelemek için, RIN-14B hücreleri, Amuc_1100 ve Pam3CSK4 ile işlem görmeden önce 1 saat boyunca bir TLR2 inhibitörü CU-CPT22 (1 μM) ile inkübe edilmiştir. Hank’in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile işleme tabi tutulan RIN-14B hücreleri, negatif kontrol olarak kullanılmıştır. İşlemden sonra hücre süpernatanları ve RNA’lar toplanmış ve ileriki analizler için -80 °C’de depolanmıştır. 

Caco-2 hücreleri, %20 FBS ve 100 U ml^-1 penisilin ve 100 μg ml^-1 streptomisin ile desteklenmiş MEM içinde kültürlenmiştir. Caco-2 hücreleri, 6 oyuklu bir plaka içinde oyuk başına cm² başına 8 x 10⁵ hücre olacak şekilde ekilmiş ve 37 °C’de 48 saat süreyle inkübe edilmiştir. Kültürlenmiş Caco-2 hücreleri, 24 saat boyunca Pam3CSK4 (5 μg ml^-1) veya Amuc_1100 (20 μg ml^-1) ile işlem görmüştür. TLR2’nin sinyal yolunu incelemek için, Caco-2 hücreleri, Amuc_1100 ve Pam3CSK4 ile işlem görmeden önce 1 saat boyunca TLR2 inhibitörü CU-CPT22 (1 μM) ile inkübe edilmiştir. Hank’in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile işlem gören Caco-2 hücreleri, negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Uygulamadan sonra, RNA toplanmış ve ileriki analizler için -80 °C’de depolanmıştır. 

2.4. Amuc_1100 ve TLR2 etkileşiminin ELISA tespiti

ELISA plakaları 5 µg mL^-1 TLR2 (1-587 kalıntıları, katalog no. 10061-H08B; Sino Biological, Pekin, Çin) ile kaplanmış ve gece boyunca 4 °C’de inkübe edilmiş, ardından 37 °C’de 120 dakika boyunca %5 sığır serum albümin proteini ile bloke edilmiştir. Amuc_1100-biotin (20 μg mL^-1 başlangıç konsantrasyonu; 3 kez seri olarak seyreltilmiş) her mikroplaka oyuğuna eklenmiş ve 37 °C’de 60 dakika reaksiyona girmesine olanak tanınmıştır. Daha sonra HRP (yabanturpu peroksidaz)-streptavidin sekonder antikorları (1:5000 seyreltme; katalog no: ab178563; Abcam) her oyuğa eklenmiş ve 20 dakika reaksiyona girmesine izin verilmiştir. Son olarak, bir tetrametilbenzidin (TMB) substratı eklenmiş ve renk gelişimi için 10 dakika reaksiyona girmesine olanak tanınmıştır. Reaksiyon, 2 M HCl eklenerek durdurulmuştur. Biz mikroplakadaki her bir oyuğun absorbansını 450 nm dalga boyunda ölçtük.

2.5. ELISA tarafından 5-HT konsantrasyonunun belirlenmesi

Dondurulmuş kolon doku örnekleri çözdürüldü, tartıldı ve 8000 rpm’de 45 saniye boyunca elle tutulan bir doku homojenleştirici kullanılarak buz üzerinde PBS (w/v, 1:9) ile homojenleştirilmiştir. Daha sonra homojenat 5000 g’de 4 °C’de 10 dakika santrifüj edilmiştir. Doku homojenatlarının süpernatanlarındaki 5-HT seviyeleri, üreticinin talimatlarına göre (Jianglaibio, Şanghay, Çin) fare 5-HT ELISA Kiti ile belirlenmiş ve RIN-14B hücrelerinin süpernatanlarındaki 5-HT seviyeleri, üreticinin talimatlarına göre (Jianglaibio, Şanghay, Çin) sıçan 5-HT ELISA Kiti tarafından tespit edilmiştir.

2.6. Nicel gerçek zamanlı PCR

Toplam RNA, TRIzol reaktifi (GenStar, Beijing, Çin) kullanılarak RIN-14B hücreleri, Caco-2 hücreleri ve fare kolon dokularından ekstrakte edilmiştir. Toplam RNA, bir OneDrop spektrofotometresi (OneDrop, Çin) kullanılarak nicelendirilmiştir. RNA saflığı, 260/280 nm’de absorbans oranı ile değerlendirilmiştir. cDNA, HiScript III cDNA Sentez Kiti (Vazyme, Nanjing, Çin) kullanılarak toplam RNA’nın 2 μg’ından hazırlanmıştır. Göreceli kantitatif RT-PCR amplifikasyonu, aşağıdaki primerler ile 1 μM konsantrasyonda AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (Vazyme, Nanjing, Çin) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sıçan, fare ve insan Tph1, SERT, Nfkb1 ve GAPDH’yi saptamak için PCR primer dizileri Tablo 2’de listelenmiştir. Referans gen olarak GAPDH kullanılmıştır. Nicel gerçek zamanlı RT-PCR (qRT-PCR), bir Bio-Rad CFX96 gerçek zamanlı PCR Tespit Sistemi (Bio-Rad, Hercules, CA) kullanılarak bir SYBR yeşil floresan boya ile gerçekleştirilmiştir. Veriler 2^−ΔΔCT yöntemine göre analiz edilmiş ve göreceli bolluklar (ortalama ± SEM) olarak ifade edilmiştir. 

h, m ve r sırasıyla insanlardan, farelerden ve sıçanlardan türetilen genleri temsil etmektedir.

2.7. Western blotlama 

RIN-14B hücreleri, Caco-2 hücreleri ve fare kolonları, 1 mM fenilmetansülfonil florür (PMSF) içeren RIPA tamponu içinde izole edilmiştir. Her gruptan eşit sayıda protein homojenatı (toplam proteinin 20 μg’i) %12 SDS-PAGE jelleri üzerine elektroforez uygulanmış ve daha sonra elektroblotlama ile PVDF membranlarına aktarılmıştır. Membranlar, oda sıcaklığında 4 saat boyunca %5 yağsız kurutulmuş süt ile bloke edilmiş ve tavşan anti-triptofan hidroksilaz antikoru (1:750) (Abcam, ABD) ve keçi anti-SERT antikoru (1:3000) (Abcam, ABD) ile gece boyunca 4 °C’de problanmıştır. Membran yıkanmış ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında anti-tavşan veya keçi HRP-bağlı Ab (1:3000; zsbio, Çin) ile inkübe edilmiştir. Membranlar, Sparkjade ECL süper kiti (Sparkjade, Shandong, Çin) ile birleştirilmiş ve bir JS-1070 (P&Q Science and Technology, Şanghay, Çin) kullanılarak görselleştirilmiştir. β-Actin, yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. Homojenize dokuların toplam protein konsantrasyonu, BCA Protein Test Kiti (Beyotime, Çin) kullanılarak belirlenmiştir. Dansitometrik analiz, ImageJ yazılımı (NIH, ABD) kullanılarak western blotlar üzerinde gerçekleştirilmiştir.

2.8. Bağırsak histolojisi

Fare kolonu yaklaşık 1 cm’lik bölümlere kesilmiş ve 4 °C’de 20 saat boyunca %4 paraformaldehit solüsyonunda sabitlenmiştir. Sabitlenmiş dokular, PBS içinde %30 (v/v) sakkaroza transfer edilmiş ve optimum kesme sıcaklığı bileşiğine gömülmeden önce gece boyunca 4 °C’de dengelenmiştir. Kolon, 20 µm kalınlığında donmuş bölümler halinde kesilmiş ve lamlara yerleştirilmiş ve lamlar, %5 Triton X-100 içeren bir fosfat tamponu ile yıkanmış ve antijeni onarmak için 100 mM glisin ile inkübe edilmiştir. Kesitler %5 BSA ile bloke edildikten sonra kesitler, tavşan anti-fare 5-HT (1:500; Abcam) birincil antikorlar ve Alexa Fluor 594 (Abcam) konjuge ikincil antikorlar kullanılarak boyanmıştır. 

2.9. Bağırsak mikrobiyotasının analizi

Üreticinin protokollerine göre, TIANamp Dışkı DNA Kiti (Tiangen Biotech, Beijing, Çin) kullanılarak dışkı örneklerinden toplam bakteri DNA’sı alınmıştır. Bakteriyel 16S rRNA’nın V3–V4 bölgeleri evrensel primerler (338F: 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′, 806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) ile amplifiye edilmiştir. Amplifiye edilen ürünler %2 agaroz jel elektroforezi ile belirlenmiş ve AxyPrep DNA jel ekstraksiyon kiti (Axygen Biosciences, Union City, CA, ABD) kullanılarak jelden geri kazanılmış, Tris-HCl ile yıkanmış ve %2 agaroz jel elektroforezi ile doğrulanmıştır. PCR amplikonları bir QuantiFluorTM-ST florometre (Promega Biotech, Beijing, Çin) kullanılarak ölçülmüş ve örnekler dizilim için gerektiği gibi ayarlanmıştır. Sıralama, bir Illumina MiSeq platformu (San Diego, CA, ABD) kullanılarak Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology (Şanghay, Çin) tarafından gerçekleştirilmiştir.  

Ham fastq dosyaları, QIIME61 (sürüm 1.17) kullanılarak nitelikli filtrelenmiştir. Birleştirilemeyen okumalar reddedilmiştir. Operasyonel taksonomik birimler (OTU’lar), Uparse (versiyon 7.0.1090) kullanılarak %97 benzerlikle kümelenmiş ve kimerik diziler UCHIME kullanılarak tanımlanmış ve çıkarılmıştır. Her dizinin taksonomisi, RDP Sınıflandırıcısı ile Silva (SSU132) 16S rRNA veritabanına karşı %70 güven eşiği ile analiz edilmiştir.^39,40 Topluluğun zenginliğini ve çeşitliliğini değerlendirmek için alfa çeşitlilik matrisi için Sobs, Shannon, Ace, Chao ve PD indeksleri seçilmiştir. Temel bileşen analizi (PCA) grafiği ve Venn şeması, R programlama dili kullanılarak uygulanmıştır. 

2.10. Dışkı parametre ölçümleri

Suya serbest erişim ile gece boyunca tutulduktan sonra farelere, Evans mavisi (%5) ve metil selüloz içeren yarı sıvı bir çözelti (0.2 ml) gavaj yoluyla uygulanmıştır. Fareler, temiz filtre kağıdı bulunan üstü filtreli bir kafese tek başına yerleştirilmiş ve dışkıları 2 saat içinde toplanmıştır. Fekal su içeriği, deney sonunda ve kurutma sonrasında peletlerin ağırlığı karşılaştırılarak ölçülmüştür. 

2.11. İstatistik

Veriler, üç bağımsız deneyin ortalamasının ortalama ± standart hatası olarak ifade edilmiştir. Ortalamalar arasındaki farklar, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey’nin HSD’si kullanılarak değerlendirilmiştir. Analiz için IBM SPSS yazılımı (IBM SPSS Statistics 25) kullanılmış; P < 0.05 anlamlı kabul edilmiştir. 

3. Sonuçlar

3.1. Amuc_1100, TLR2 ile doğrudan etkileşim yoluyla RIN-14B hücrelerinde NF-κB yolunu aktive etmektedir

A. muciniphila ve Amuc_1100’ün TLR2 eksprese eden insan HEK-Blue hücrelerini aktive edebildiği bildirilmiştir.¹³  Önceki araştırma sonuçlarımız, E. coli’den heterolog olarak eksprese edilen Amuc_1100’ün TLR2 ile doğrudan etkileşime girebileceğini ortaya koymuştur.³⁷ Bu sebeple A. muciniphila’nın, dış zar proteini Amuc_1100 ve TLR2 arasındaki doğrudan etkileşim yoluyla karşılık gelen sinyal yollarını aktive ettiğini tahmin ettik. RIN-14B hücre hattı, bağırsak hücre fonksiyonu için geleneksel bir modeldir. RIN-14B hücreleri, 1 μM TLR2 inhibitörü CU-CPT22 ile 1 saat ön işleme tabi tutularak veya tutulmaksızın E. coli’den eksprese edilen Amuc_1100 ile işlem görmüştür.  24 saat sonra, bu hücrelerde nükleer faktör kappa B alt birim 1 (Nfkb1) mRNA’sının ekspresyonu incelenmiştir. Veriler, Pam3CSK4 (TLR2 agonisti) gibi Amuc_1100’ün Nfkb1 mRNA ekspresyonunu destekleyebileceğini göstermiştir. Aynı zamanda, TLR2 inhibitörü CU-CPT22 bu etkiyi ortadan kaldırmış (Şekil 1A), bu da A. muciniphila dış zar proteini Amuc_1100’ün TLR2 ile doğrudan etkileşime girerek ilgili sinyal yolunu aktive ettiğini düşündürmüştür. ELISA deney sonuçları, Amuc_1100’ün TLR2’yi güçlendirmeye yönelik EC50’nin 0,3 µg ml^-1 olduğunu ortaya çıkarmıştır (Şekil 1B).

Şekil 1. Amuc_1100, TLR2 ile doğrudan etkileşim yoluyla RIN-14B hücrelerinde NF-κB yolunu aktive etmiştir. RIN-14B hücreleri, 1 saat boyunca veya değil TLR2 inhibitörü CU-CPT22 (1 μM) ile ön işleme tabi tutulmuş ardından 24 saat boyunca Pam3CSK4 (5 μg ml^-1) ve Amuc_1100 (5 μg ml^-1) ile işleme tabi tutulmuştur. (A) Hücre peletleri, kantitatif RT-PCR ile belirlenen GAPDH housekeeping genine (housekeeping gene: ekspresyonu değişmeyen temel gen, referans gen) normalleştirilmiş Nfkb1 ekspresyonunu analiz etmek için toplanmıştır. Kontrol, HBSS uygulanan RIN-14B hücreleri. (B) Amuc_1100 ve TLR2 arasındaki etkileşimin ELISA ile belirlenmesi. Veriler, üç bağımsız deneyi temsil etmektedir ve ortalama ± SEM olarak temsil edilmektedir. *P < 0.05, **P < 0.01 ve ***P < 0.001, Tukey’nin son testi kullanılarak tek yönlü ANOVA ile belirlenmiştir. 

3.2. Amuc_1100, TLR2 sinyali yoluyla RIN-14B hücrelerinde Tph1 ekspresyonunu ve 5-HT sentezini arttırmaktadır

Amuc_1100, TLR2’ye doğrudan bağlanabildiğinden ve akış-aşağı sinyalleşmesini etkinleştirebildiğinden, Amuc_1100’ün TLR2 vasıtasıyla EC hücrelerinde bağırsak 5-HT biyosentezini etkileyip etkilemediğini ayrıca araştırdık. RIN-14B hücre hattını bir EC hücre fonksiyonu modeli olarak kullandık ve 5-HT sentez hızı sınırlayıcı enzim Tph1’in ekspresyonunu incelemeden önce 24 saat RIN-14B hücrelerini Amuc_1100 ile muamele ettik. Amuc_1100’ün Tph1’in mRNA ve protein seviyelerini desteklediğini bulduk (Şekil 2A ve C). Amuc_1100’ün Tph1 ekspresyonunu destekleme üzerindeki etkisinin TLR2 sinyal yolu aracılığıyla uygulandığını test etmek ve doğrulamak için, RIN-14B hücrelerini 1 saat CU-CPT22 ile inkübe ettik ve sonra hücrelere 24 saat Amuc_1100 veya Pam3CSK4 ile muamele ettik. Verilerimiz, CU-CPT22’nin, Amuc_1100 veya Pam3CSK4 tarafından desteklenen gelişmiş hücre içi Tph1 ekspresyonunu hem mRNA hem de protein seviyelerinde belirgin şekilde azaltabildiğini göstermiştir (Şekil 2B ve C). Ayrıca, hücre süpernatanlarındaki 5-HT konsantrasyonlarının test sonuçları ayrıca Amuc_1100’ün 5-HT biyosentezini arttırdığını ve Amuc_1100 tarafından 5-HT üretiminin bu artışının benzer şekilde CU-CPT22 tarafından bastırıldığını göstermiştir (Şekil 2B). Bu sonuçlar, Amuc_1100’ün TLR2 sinyal yolunu aktive ederek ve sonuç olarak 5-HT biyosentezini teşvik ederek RIN-14B hücrelerinde Tph1 transkripsiyonunu ve ekspresyonunu artırabileceğini göstermektedir.

Şekil 2. Amuc_1100, TLR2 sinyali yoluyla RIN-14B hücrelerinde Tph1 ekspresyonunu ve 5-HT sentezini arttırmıştır. RIN-14B hücreleri, 24 saat boyunca Amuc_1100 veya Pam3CSK4 ile işlem görmüştür. Süpernatantlar ve hücre peletleri, 1 saat boyunca veya değil bir TLR2 inhibitörü (CU-CPT22: 1 μM) ile ön işleme tabi tutulduktan sonra kantitatif RT-PCR tarafından belirlenen GAPDH housekeeping genine normalize edilmiş (A) Tph1 ekspresyonunu ve ardından 24 saat boyunca Pam3CSK4 veya Amuc_1100 ile aktivasyonunu analiz etmek için toplanmıştır. (B) TLR2 inhibitörü CU-CPT22 ile 1 saat veya değil ön işleme tabi tutulduktan sonra hücre süpernatanlarında Amuc_1100 veya Pam3CSK4 uygulaması üzerine 5-HT seviyeleri ve sonrasında 24 saat boyunca Pam3CSK4 veya Amuc_1100 ile aktivasyonu. (C) TLR2 inhibitörü (CU-CPT22: 1 μM) ile 1 saat veya değil önişlemden sonra ve ardından 24 saat Amuc_1100  ile muamele ve 24 saat Amuc_1100 uygulamasından (20 μg ml⁻¹) sonra RIN-14B hücre lisatlarında dansitometre ile ölçülen Tph1’in western blotlaması ve Tph1 için belirli bantların temsili görüntüleri. Kontrol, HBSS uygulanan RIN-14B hücreleri. Veriler, üç bağımsız deneyi temsil etmekte ve ortalama ± SEM olarak ifade edilmektedir. *P < 0.05, **P < 0.01 ve ***P < 0.001, Tukey’nin son testi kullanılarak ANOVA yoluyla belirlenmiştir. 

3.3. Amuc_1100, TLR2 sinyali yoluyla Caco-2 hücrelerinde SERT ekspresyonunu azaltmaktadır

5-HT’nin aktivitesi başlıca hücre dışı varlığına bağlıdır. Caco-2/TC7 hücrelerinde TLR2’nin aktivasyonunun, artan 5-HT hücredışı varlığı ile sonuçlanan SERT ekspresyonunu engelleyebildiği bildirilmiştir.³⁴ Amuc_1100 tarafından TLR2’yi etkinleştirdikten sonra SERT ekspresyonunun değişip değişmediğini test etmek için, SERT ekspresyonunu belirlemeden önce Caco-2 hücrelerini Amuc_1100 ile 24 saat muamele ettik. Sonuçlarımız, Pam3CSK4 gibi Amuc_1100’ün Caco-2 hücrelerinde SERT mRNA ve protein seviyelerini azalttığını göstermiştir (Şekil 3A–C). Daha sonra, hücreleri Amuc_1100 ile 24 saat inkübe etmeden önce Caco-2 hücrelerini 1 saat CU-CPT22 ile ön işleme tabi tuttuk ve CU-CPT22’nin Amuc_1100’ün hücresel SERT ekspresyonu üzerindeki engelleyici etkisini ortadan kaldırabileceğini bulduk (Şekil 3A–C). Bu sonuçlar, Amuc_1100’ün TLR2 aracılığıyla Tph1 ekspresyonunu artırabildiğini ve TLR2 aracılığıyla SERT ekspresyonunu bastırabildiğini, böylece 5-HT’nin hücredışı kullanılabilirliğini artırabildiğini göstermektedir.

Şekil 3. Amuc_1100, TLR2 sinyali aracılığıyla Caco-2 hücrelerinde SERT ekspresyonunu azaltmıştır. (A) TLR2 inhibitörü (CU-CPT22: 1 μM) ile 1 saat veya değil ön uygulamadan sonra 24 saat boyunca Pam3CSK4 veya Amuc_1100 uygulanan hücrelerde SERT mRNA ekspresyon seviyesinin gerçek zamanlı PCR’si ve 24 saat boyunca Pam3CSK4 veya Amuc_1100 ile ardından aktivasyonu. Nisbi niceleme, karşılaştırmalı Ct yöntemi (2^−ΔΔCT) kullanılarak yapılmıştır. Sonuçlar rasgele seçilmiş birimler olarak ifade edilmekte (kontrol = 1) ve üç bağımsız deneyin ortalama ± SEM’sidir. **P < 0.01 ve *P < 0.05, kontrol değeriyle karşılaştırılması. (B) TLR2 inhibitörü (CU-CPT22: 1 μM) ile 1 saat veya değil süreyle ön işleme tabi tutulduktan sonra Caco-2 hücre lizatlarında SERT proteininin western lekelenmesinin temsili görüntüsü ve ardından 24 saat Amuc_1100 ile muamele. (C) SERT için spesifik bantlar, dansitometri ile ölçülmüştür. β-Actin, yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. Kontrol, HBSS ile işlem görmüş Caco-2 hücreleri. Veriler, üç bağımsız banttan protein ekspresyonunun nispi yoğunluklarını göstermekte ve ortalama ± SEM olarak ifade edilmektedir. *P < 0.05, **P < 0.01 ve ***P < 0.001, Tukey’nin son testi kullanılarak tek yönlü ANOVA ile belirlenmiştir.

3.4. A. muciniphila ve Amuc_1100, farelerin kolonlarında 5-HT biyosentezini desteklemektedir

Geniş spektrumlu antibiyotikler uygulanan fareler, oldukça azalmış bağırsak mikrobiyotası ve bağırsakta 5-HT konsantrasyonunda azalma sergilemişlerdir.²⁷ Bu nedenle biz, bir hayvan modeli olarak antibiyotik uygulanan fareleri kullandık ve A. muciniphila ve Amuc_1100’ün murin bağırsak 5-HT sistemi üzerindeki etkilerini test ettik. C57BL/6 farelerine üç hafta boyunca geniş spektrumlu antibiyotikler uygulandıktan sonra, farelere iki hafta boyunca A. muciniphila veya Amuc_1100 gavaj yoluyla verilmiştir. Daha sonra ELISA gerçekleştirilmiş ve farelerin kolonlarında ve serumlarında dikkate değer 5-HT seviyeleri tespit edilmiştir (Şekil 4A ve B). Eşzamanlı olarak kolon Tph1 ve SERT mRNA seviyelerini de inceledik ve hem A. muciniphila hem de Amuc_1100’ün kolonda Tph1 ekspresyonunu artırdığını (Şekil 4C) ve SERT ekspresyonunu azalttığını (Şekil 4D) bulduk. Ayrıca immünohistokimya verileri antibiyotik uygulanan farelerde kolonik 5-HT boyamasını önemli ölçüde azalttığını ve antibiyotik uygulanan farelerde kolonik 5-HT içeriklerinin A. muciniphila veya Amuc_1100 ile gavajdan sonra önemli ölçüde arttığını göstermiştir (Şekil 4E–H). Bu sonuçlar, A. muciniphila ve Amuc_1100’ün konakçının bağırsak 5-HT biyosentezini destekleyebileceğini göstermektedir.

Şekil 4. A. muciniphila ve Amuc_1100, farelerin kolonlarında 5-HT biyosentezini destekler. (A) Kolonik 5-HT seviyeleri (n = grup başına 3 fare). (B) Serumdaki 5-HT seviyeleri. (C) Kantitatif RT-PCR tarafından belirlenen GAPDH housekeeping genine normalize edilmiş kolonik Tph1 ekspresyonu. (D) Kantitatif RT-PCR tarafından belirlenen GAPDH housekeeping genine normalize edilmiş kolonik SERT ekspresyonu. (E–H) Amuc_1100 ve A. muciniphila uygulamasıyla geniş spektrumlu antibiyotikle işlem görmüş farelerde 5-HT için boyanmış kolonların temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu 60 μm’dir. Kontrol grubunda normal farelere günlük olarak PBS; antibiyotik grubunda antibiyotik uygulanan farelere günlük olarak PBS; Amuc_1100 grubunda antibiyotik uygulanan farelere günlük olarak Amuc_1100; Akk grubunda antibiyotik uygulanan farelere günlük olarak A. muciniphila gavaj yoluyla verilmiştir. Veriler, üç bağımsız deneyi temsil etmekte ve ortalama ± SEM olarak ifade edilmektedir. *P < 0.05, **P < 0.01 ve ***P < 0.001, Tukey’nin son testi kullanılarak tek yönlü ANOVA ile belirlenmiştir. 

3.5. A. muciniphila ve Amuc_1100, antibiyotik uygulanan farelerde gastrointestinal motiliteyi iyileştirmektedir

Bağırsakların 5-HT seviyeleri doğrudan gastrointestinal motilite fonksiyonu ile ilişkilidir ve nicel değişiklikler gastrointestinal peristaltizm değişikliklerine yol açacaktır. Deneylerimiz, A. muciniphila ve Amuc_1100’ün kolonik 5-HT seviyelerini artırabildiğini ortaya koyduğundan, bunun bağırsak hareketliliğini iyileştirip iyileştirmeyeceğini sorgulayacağız. Bir hayvan modeli olarak antibiyotik uygulanmış fareler kullandık, A. muciniphila veya Amuc_1100 ile gavajdan sonra 2 saatte üretilen dışkı peletlerinin sayısını saydık ve karşılık gelen dışkı su içeriğini ölçtük. Sonuçlarımız, farelere antibiyotik uygulandıktan sonra 2 saatte dışkılama oranının önemli ölçüde azaldığını göstermiştir (Şekil 5A), kontrol grubu için 2 saatte 10.5 pelet ve antibiyotik uygulanan grup için 2 saatte 8.5 pelettir. A. muciniphila veya Amuc_1100 ile gavaj sonrası barğırsak hareketlerinin sayısı belirgin şekilde artmıştır. Bu farelerde dışkıların su içeriğini ölçtük ve antibiyotik uygulanan farelerde dışkı su içeriğinin azaldığını ve bu antibiyotik uygulanan farelerde dışkı peletlerinin su içeriğinin A. muciniphila veya Amuc_1100 ile gavaj aracılığıyla iyileştirilebileceğini bulduk (Şekil 5B). Bu sonuçlar, A. muciniphila ve Amuc_1100’ün murin gastrointestinal motilitesini artırabildiğini ve bağırsak fonksiyonunu iyileştirebildiğini göstermektedir. 

Şekil 5. A. muciniphila ve Amuc_1100, antibiyotik uygulanan farelerde gastrointestinal motiliteyi iyileştirmiştir. (A) Dışkılama oranı, toplam geçiş süresine (n = 4) göre 2 saat içinde üretilen dışkı peletlerinin sayısıyla ölçülmektedir. (B) Dışkı su içeriği, 2 saatte üretilen dışkı peletlerinin su içeriği ile ölçülmektedir (n = 4). Kontrol grubunda normal farelere günlük olarak PBS; antibiyotik grubunda antibiyotik uygulanan farelere günlük olarak PBS; Amuc_1100 grubunda antibiyotik uygulanan farelere günlük olarak Amuc_1100; ve Akk grubunda antibiyotik uygulanan farelere günlük olarak A. muciniphila verilmiştir. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. *p < 0.05 ve **p < 0.01, Tukey’nin son testi kullanılarak tek yönlü ANOVA ile belirlenmiştir.

3.6. A. muciniphila ve Amuc_1100, antibiyotik uygulanan farelerde bağırsak mikrobiyotasını restore etmektedir

Bağırsak mikrobiyotası ve 5-HT seviyesi arasındaki ilişki çift yönlüdür ve bağırsak 5-HT’deki artış aynı zamanda bağırsak mikrobiyomunun kompozisyonunu da etkileyecektir. Örneğin, Clostridia ve Turicibacteraceae’nin bolluğu özellikle yüksek 5-HT seviyeleri ile artmıştır.^29,32 Bu nedenle, antibiyotik uygulanan farelerde A. muciniphila ve Amuc_1100’ün bağırsak mikrobiyota bileşimi üzerindeki etkilerini araştırdık. A. muciniphila veya Amuc_1100 gavajlı veya gavajsız antibiyotik uygulanmış fareler için 16S rRNA mikrobiyom dizilimi gerçekleştirdik ve dışkı mikrobiyal topluluklarını analiz ettik. Bakteriyel V3–V4 bölgelerinde 1 242 291 yüksek kaliteli Illumina okuması elde ettik. Tüm okuma uzunlukları 401–440 bp idi; ortalama okuma uzunluğu 421 bp idi. Sıralama sonuçlarından elde edilen her fare grubu için ortalama operasyonel taksonomik birim (OTU) sayılarına ve çoklu alfa çeşitlilik metriklerine göre genel topluluk kompozisyonu ve çeşitliliği, önceki bir raporun sonuçlarıyla tutarlı bir şekilde antibiyotik uygulanan farelerin bağırsaklarında belirgin şekilde azalmıştır. A. muciniphila veya Amuc_1100 ile gavajdan sonra, antibiyotik uygulanan bu farelerin bağırsak mikrobiyota bolluğu ve çeşitliliği önemli ölçüde artmıştır (Tablo 1). 

Kontrol grubunda normal farelere günlük olarak PBS; antibiyotik grubunda antibiyotik uygulanan farelere günlük olarak PBS; Amuc_1100 grubunda antibiyotik uygulanan farelere günlük olarak Amuc_1100 ve Akk grubunda antibiyotik uygulanan farelere günlük olarak A. muciniphila verilmiştir.

Farklı fare gruplarındaki mikrobiyom bileşimini ve yapılarını karşılaştırmak için Venn diyagramını ve PCoA β çeşitlilik analizini kullandık. Antibiyotik uygulanan farelerin bağırsak mikrobiyota bileşiminin, geleneksel olarak yetiştirilen farelerden önemli ölçüde farklı olduğunu, antibiyotik uygulanmamış geleneksel grupta bulunan OTU’larla sadece 2 OTU’nun  örtüştüğünü kanıtladık (Şekil 6A ve B). A. muciniphila veya Amuc_1100 ile beslenen, antibiyotik uygulanan fareler, sırasıyla %72 veya %71 örtüşen mikroorganizmalar ile geleneksel olarak yetiştirilen farelerinkine benzer bağırsak mikrobiyota profillerine sahipti (Şekil 6A ve B). Sınıf düzeyinde analiz için, antibiyotik uygulanan farelerin bağırsakları, önceki sonuçlarla tutarlı olan yalnızca Gammaproteobacteria üyeleri içeriyordu;²⁷ A. muciniphila veya Amuc_1100 ile gavajdan sonra, antibiyotik uygulanan farelerin bağırsaklarında mikrobiyal türler artmış, bunların aralarında Clostridia sınıfının bolluğu belirgin şekilde artmıştır (Şekil 6C), bu durum yüksek 5-HT düzeylerinin farelerde bağırsak Clostridia bolluğunu arttırdığını bildiren literatürle tutarlıdır.³² A. muciniphila veya Amuc_1100 ile gavaj uygulanan farelerin bağırsak mikrobiyotası, geleneksel olarak yetiştirilen farelerinkiyle yüksek benzerliğe sahip olmasına rağmen, bazı mikropların bolluklarında farklılık göstermiştir (Şekil 6C ve D). Cins düzeyinde analiz için, A. muciniphila veya Amuc_1100 ile gavajdan sonra antibiyotik uygulanan farelerin bağırsaklarında laktobasil artmış (Şekil 6E); Lachnospiraceae cinsinin bağırsak bolluğu sadece Amuc_1100 ile gavajdan sonra artarken, A. muciniphila uygulanan fareler ile geleneksel olarak yetiştirilen fareler arasında bariz farklılıklar sergilenmemiştir (Şekil 6G). Ayrıca, antibiyotik uygulanan farelerde Dubosiella cinsinin bağırsak bolluğu Amuc_1100 ile gavajdan sonra artmasına rağmen A. muciniphila ile gavajdan sonra azalmıştır (Şekil 6F). A. muciniphila ile gavajdan sonra antibiyotik uygulanan farelerde A. muciniphila önemli ölçüde artmıştır (Şekil 6H). Bu sonuçlar, A. muciniphila ve Amuc_1100’ün antibiyotik uygulanan farelerde bağırsak mikrobiyota çeşitliliğini restore edebileceğini göstermektedir. 

Şekil 6. A. muciniphila ve Amuc_1100, antibiyotik uygulanan farelerde bağırsak mikrobiyotasını restore etmiştir. (A) Dört grup arasında bağırsak mikrobiyotasında tanımlanan OTU’ların örtüşmesini gösteren Venn şeması. (B) Ağırlıklı UniFrac mesafelerine dayalı dört grubun PCoA analizi. Her alan bir örneği temsil etmektedir. (C) Sınıf düzeyinde mikrobiyal dağılım. (D) Cins düzeyinde mikrobiyal dağılım. (E) Lactobacillus, (F) Dubosiella, (G) Lachnospiraceae ve (H) Akkermansia’nın nispi bolluğu. Kontrol grubunda normal farelere günlük olarak PBS; antibiyotik grubunda antibiyotik uygulanan farelere günlük olarak PBS; Amuc_1100 grubunda antibiyotik uygulanan farelere günlük Amuc_1100; Akk grubunda antibiyotik uygulanan farelere günlük A. muciniphila verilmiştir. Veriler ortalama ± SD olarak gösterilmektedir. n = grup başına 6; *P < 0.05; **P < 0.01; ve ***P < 0,001; Tukey’in son testi kullanılarak post hoc tek yönlü ANOVA ile belirlenmiştir. 

4. Tartışma

5-HT sistemi, bağırsak mikrobiyomu ve konakçı arasındaki karşılıklı etkileşimleri etkileyen önemli bir mekanizmayı temsil etmektedir. 5-HT, çok işlevli bir biyojenik amindir ve bir dizi fizyolojik süreçte önemli sinyal işlevleri ortaya koymaktadır. Çoğu dahili 5-HT, bağırsak mukozasındaki EC hücreleri tarafından sentezlenmektedir. Gastrointestinal motilite fonksiyonunu modüle etmenin yanı sıra, bağırsak 5-HT; trombosit agregasyonu, kemik yoğunluğu kontrolü ve glukoz homeostazı ve yağ metabolizması gibi metabolik aktivitelerle de ilişkilidir.²⁴  5-HT, bağırsak mikrobiyomunu ve konakçıyı birbirine bağlayan bir sinyal merkezidir; 5-HT seviyelerindeki değişiklikler T2D ve obezite ile ilişkilidir. Bu 5-HT seviyesi değişiklikleri, bağırsak mikrobiyotasının konakçının metabolik düzenlemesini etkilediği bir yaklaşımı temsil edebilmektedir. Bu çalışmada sunulan bulgular, bağırsak hücreleri üzerindeki A. muciniphila dış zar proteini Amuc_1100 ve TLR2 arasındaki etkileşimin, konakçıdaki bağırsak 5-HT içeriğini arttırdığına açıklık getirmiştir. Ayrıca, 5-HT sistemi gastrointestinal fonksiyonlar, inflamatuar yanıtlar ve metabolik bozukluklar dahil olmak üzere fizyolojik süreçlerle ilişkili olduğundan, A. muciniphila tarafından dış zar proteini Amuc_1100 aracılığıyla dahili 5-HT konsantrasyonlarının düzenlenmesinin, A. muciniphila’nın gastrointestinal hastalıkları ve metabolik bozuklukları iyileştirdiği veya etkilemesi aracılığıyla önemli yollardan birini temsil ettiği sonucuna varmak mantıklıdır. Bu; IBD, obezite, diyabet ve kolorektal kanser üzerinde rapor edilen A. muciniphila’nın hafifletme ve terapötik etkilerinin doğal mekanizmalarını açıklamaktadır.^13,19,20

Bağırsak mikrobiyotası, konakçı bağırsak 5-HT seviyelerini etkiler. KZYA’leri gibi spor oluşturan bakteriler tarafından üretilen metabolitlerin Tph1 transkripsiyonunu destekleyebildiği ve 5-HT biyosentezini düzenleyebildiği halihazırda tespit edilmiştir.^28,29 Bu çalışmanın deneysel sonuçları, belirtilen bağırsak mikrobu A. muciniphila’nın bu özel proteini Amuc_1100’in TLR2 sinyal yolu aracılığıyla bağırsak 5-HT mevcudiyetini destekleyebildiği ve 5-HT sistemi aracılığıyla bağırsak mikrobiyotası ile konakçı arasındaki etkileşimi doğruladığı spesifik mekanizmaları göstermektedir. Bu çalışmada, antibiyotik uygulanan farelerin kolon dokularındaki ve kanındaki 5-HT konsantrasyonları, A. muciniphila veya Amuc_1100 ile gavajdan sonra yükselmiştir. İlginç bir şekilde Yaghoubfar vd.; yakın zamanda A. muciniphila ve onun hücre dışı veziküllerinin kolon ve hipokampustaki 5-HT seviyesini artırabildiğini, ancak deney farelerinin serumundaki 5-HT seviyesini azalttığını bildirmişlerdir.⁴¹ Bu tutarsızlık birkaç nedenden kaynaklanabilir. Bunlardan biri, geleneksel fareler kullanıp fareler kurban edildikten sonra kuyruk damarından kan örnekleri almaları, bizim ise hayvan modeli olarak antibiyotik uygulanmış fareleri kullanmamız ve fareleri öldürmeden önce gözkürelerini toplayarak kan örnekleri almamız olabilir. Diğer neden, 5-HT sisteminin bağışıklık sistemi ve metabolizma ve hatta bağırsak mikrobiyotası gibi karmaşık faktörlerden etkilenmesi olabilir.^25,29,42

Bağırsak 5-HT konsantrasyonundaki değişiklikler, doğrudan konakçı fizyolojisini etkilemekte ve ayrıca konakçının çeşitli fizyolojik fonksiyonlarını etkileyerek bağırsak mikrobiyota bileşimini ve zenginliğine etki etmektedir. 5-HT, bağışıklık sistemi üzerine doğrudan veya dolaylı olarak etki edebilmekte ve akabinde mikrobiyal topluluk yapısını ve kolonizasyonuna etki etmekte; konakçının bağışıklık tepkilerini düzenlemek, konakçının patojenik bakteriler veya kommensal bakterilerle nasıl başa çıktığını etkilemektedir.³⁰ T. sanguinis, memeli SERT’sine homolog bir proteine sahiptir.Bağırsak 5-HT bu bakterinin gelişmesini desteklemiş ve ardından lipid ve steroid metabolizmasında yer alanlar dahil olmak üzere birçok konakçı genetik yolakların bağırsak ekspresyonunu etkilemiştir böylece konakçıdaki trigliserit seviyelerini düşürmüştür.³² Bu çalışma, A. muciniphila ve onun dış zar proteini Amuc_1100’ün antibiyotik uygulanan farelerin bağırsak mikrobiyota bileşimini restore edebildiğini ve bağırsak 5-HT ile bağırsak mikrobiyotası arasındaki çift yönlü ilişkiyi gösterdiğini ortaya koymuştur.

Amuc_1100 veya A. muciniphila; 5-HT biyosentezini destekleyebilmekte ve farelerin kolonlarındaki seviyesini iyileştirebilmekte, bu da bağırsak işlevini ve beslenmeyi düzeltebilmektedir. Besleyici materyal hatta 5-HT’nin kendisi bile, belirli bağırsak bakteriyel büyümesini destekleyebilir. 5-HT, konakçı bağışıklık sistemi vasıtasıyla bağırsak mikrobiyotasını etkileyebilmekte, buda bağırsak bakterilerinin kolonizasyonuna ve etkileşimine etki edebilmektedir. 

Araştırmalar, bağırsak fizyolojik işlev bozuklukları ve zihinsel sağlık bozuklukları arasındaki ilişkiyi göstermiştir. Örneğin, otizm spektrum bozukluğuna (ASD) sahip çocuklar sıklıkla mide ağrıları, ishal veya kabızlık gibi mide-bağırsak rahatsızlıkları sergilemekte^43,44 bunlara bazen iltihaplı bağırsak hastalığı da eşlik etmektedir.⁴⁵ Ayrıca kronik kabızlığı olan hastalarda depresyon prevalansı %33 daha yüksek idi.^44,46 Dahası konakçıdaki metabolik işlev bozukluğu genellikle ruhsal bozukluk ile ilişkilendirilmiştir. Örneğin, obezite, tip 1 ve T2D dahil olmak üzere metabolik fonksiyon bozuklukları olan hastalarda depresyon semptomları daha sık bulunmuştur.^47-49  ENS ve CNS’nin gelişimi ve işlevi için anahtar düzenleyici olarak 5-HT; muhtemelen bağırsak-beyin-mikrobiyom bağına bağlanabilir. Salgılanan 5-HT; inaktivasyonundan önce hücrelere geri taşınmalıdır. Tph1 ve SERT ekspresyonlarındaki değişiklikler, nörotransmisyon için kullanılan 5-HT konsantrasyonlarında değişikliklere neden olabilmektedir. 5-HT’nin nörotransmisyon davranışları da bağırsak mikrobiyotasından etkilenmektedir. Bağırsak mikrobiyotasının triptofan metabolizması ve 5-HT sistemi üzerindeki etkisi muhtemelen bu düzenleme için önemli bir faktördür. Bu tartışmanın altında yatan mekanizmaların daha fazla açıklığa kavuşturulması gerekmektedir.