Müsin degradasyonunda yer alan Akkermansia muciniphila’dan bir GH3 β-N-asetilheksozaminidazın fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu

ÖZET

Akkermansia muciniphila, bağırsak mukusunun dış tabakasında kolonize olan ve metabolik bozukluklarla negatif ilişkili olan bir probiyotiktir. A. muciniphila’dan bir β-N asetilheksozaminidaz olan Amuc_2109 proteini, müsinlerin parçalanmasına yer alabilir ve bağırsak sağlığı ile ilişkilidir. Burada biz, GH ailesi 3 enzimlerine ait olan ve aktif merkeze bağlı GlcNAc ile kanonik (α/β)₈ TIM barrel yapısına katılan Amuc_2109’un kristal yapısı bildirdik. Amuc_2109’un biyokimyasal analiz karakterizasyonu, Amuc_2109’un bağırsak ortamında Amuc_2109’un hayatta kalma avantajını yansıtan, geniş bir sıcaklık ve pH aralığında aktif olan bir GlcNAc’ye özgü glikozidaz olduğunu ortaya koymuştur. Yapısal ve biyokimyasal sonuçlarımız, GH3 β-N-asetilheksozaminidazın katalitik mekanizmasının anlaşılmasına katkıda bulunacak ve kompleks karbonhidrat kullanımının moleküler mekanizması ve A. muciniphila’daki bağırsak bariyerinin restorasyonu hakkında fikir edinmeye yardımcı olacaktır.

1.Giriş

Goblet hücreleri tarafından salgılanan müsinler, yalnızca bağırsak epitelini korumakla kalmayıp aynı zamanda konakçı-bakteriyel koloni etkileşimleri için anahtar bir arayüz görevi gören bağırsağın mukus bariyerini oluşturmaktadır [1-4]. Yoğun şekilde O-glikosile müsinler, bağırsak florasının düzenlenmesinde, mukus bariyerinin korunmasında ve immün sinyalleşmede önemli bir rol oynar [5,6]. Bağırsak mikropları, müsin glikanlarını parçalayabilir ve konakçı mukus üretimini ve bağışıklık ve metabolik tepkileri kolaylaştıran çok sayıda yan ürün üretebilir [7-10]. 

Akkermansia muciniphila, bağırsak mukus tabakasında stabil bir şekilde kolonize olan bağırsak komensal bir bakteridir [11]. A. muciniphila; kolit [12], metabolik sendrom [13], diyabet [14] gibi çeşitli hastalıklarla negatif ilişkili olan bir probiyotik olarak kabul edilir. A. muciniphila’nın probiyotik etkisini gösterdiği mekanizma, bağırsaktaki mukus kalınlığını düzenleyebilmesi ve bağırsak bariyerinin bütünlüğünü koruyabilmesi olabilmektedir [15]. A. muciniphila; α-fukosidazlar, α-sialidazlar, β-galaktosidazlar, β-N-asetilheksosaminidazlar ve α-N-asetilglukozaminidazlar [11,16] gibi çok sayıda sülfataz ve glikozit hidrolazı (GH) eksprese ederek müsinleri metabolize eder. β-N-asetilheksozaminidazlar (EC 3.2.1.52); göz kırpan N-asetilglukozamin (GlcNAc) veya N-asetilgalaktozaminin (GalNAc) [17] terminal birimlerini serbest bırakan bir glikozidaz sınıfıdır. Onların dizileme homolojilerine dayanarak, β-N-asetilheksozaminidazlar; dört glikozit hidrolaz aileleri; GH3, GH20, GH84 ve GH85 olarak sınıflandırılmış ve GH20 en çok çalışılmıştır [18]. β-N-asetilheksozaminidazların kristal yapı çalışmaları, dört ailenin katalitik alanlarının tümünün (β/α)₈ barrel yapıları olduğunu 8 tekrar eden β-şeritli/döngü/heliks biriminden oluşan, 8 β-şeritli bir β-barrel yapısı oluşturduğunu göstermiştir [19,20]. Bununla birlikte onlar farklı katalitik mekanizmalara sahiptirler. GH20, GH84 ve GH85 aileleri β-N-asetilheksozaminidazlar; kataliz için substratların asetil gruplarının dahil edilmesini gerektirirler oysa GH3 ailesi β-N-asetilheksozaminidazlar ise kataliz elde etmek için sadece kendi katalitik amino asit kalıntılarını kullanır [21]. 

A.muciniphila genomu, 11’i GH20 ailesine ait olan 12 β-N-asetilheksosaminidaz kodlar; tek istisna ise, GH3 ailesine ait olan Amuc_2109’dur. Bugüne kadar, üç GH20 ailesi A. muciniphila β-N-asetilheksozaminidazlardan Amuc_0868 [22], Amuc_2018 [23] ve Amuc_2136 [24]’ın kristal yapıları rapor edilmiştir. Bununla birlikte, tek GH3 ailesi A. muciniphila β-N-asetilheksosaminidaz Amuc_2109’un biyokimyasal özellikleri ve yapısal özellikleri belirsizliğini korumaktadır. Bu çalışmada; Amuc_2109 GlcNAc’ye özgü bir glikozidaz olarak tanımlanmış ve onun enzimatik özellikleri karakterize edilmiştir. Ayrıca apo Amuc_2019 ve Amuc_2109’un kristal yapıları GlcNac ile kompleks halinde çözülmüştür. Yapısal sonuçlarımız, Amuc_2109’un GH3 ailesi glikosidazlarının tipik bir katalitik mekanizmasına sahip olduğunu ortaya çıkarmıştır.

2. Materyaller ve Metotlar

2.1. Protein ekspresyonu ve saflaştırma

Amuc_2109’u kodlayan DNA fragmanı, PCR yöntemiyle üretilmiştir. Primerler, bir C-ucu His6-etiketi içeren pET22b’yi eklemeye izin vermek için NdeI ve XhoI kısıtlama enzimi bölgelerini tanıtmak üzere tasarlanmıştır. Rekombinant plazmitler, DNA dizilemesi ile doğrulanmış ve protein ekspresyonu için Escherichia coli suşu BL21’e (DE3) dönüştürülmüştür. Hücre, OD₆₀₀ 0.6-0.8’e ulaşana kadar 37°C’de 30 mg/L ampisilin içeren LB ortamında kültürlenmiş ve daha sonra 16°C’de 18 saat boyunca 0.4 mM izopropil-β-D-tiogalaktozid (IPTG) ilavesiyle indüklenmiştir. Hücreler, 10 dakika boyunca 4000 rpm’de santrifüjleme ile toplanmış ve 50 mM TriseHCl (pH 7.0) ve 500 mM NaCl’den oluşan bir tampon içinde yeniden süspanse edilmiş ve sonikasyon ile çözünmüştür. Proteinler, Ni-NTA afinite kolonu ile saflaştırılmış ve hedef protein, 50 Mm TriseHCl (pH 7.0), 500 mM NaCI ve 300 mM imidazol içeren bir tamponla ayrıştırılmıştır. Ayrılan proteinler, santrifüjlü ultrafiltrasyon ile konsantre edilmiş ve 50 mM TriseHCl (pH7.0) ve 500 mM NaCl içeren bir tampon içinde bir Hiload 16/60 Superdex 75 PG kolonunda (GE Healthcare) daha ileri saflaştırılmıştır. Saflaştırılmış Amuc_2109’un protein konsantrasyonu, sonraki analiz için Bradford yöntemi kullanılarak miktarı ölçülmüştür. 

2. Enzim aktivite analizi

Amuc_2109’un aktivitesi, pNP-substratlarından p-nitrofenol (pNP) salınımını ölçmek için 405 nm’de spektrofotometrik analiz kullanılarak belirlenmiştir. Amuc_2109 proteini, 100 ml önceden ısıtılmış 50 mM Tris-HCl, pH 7.0, 500 mM NaCl ve 1 mM pNP-substratına ilave edilmiştir ve 37 ˚C’de 10 dakika inkübe edilmiş ardından reaksiyonu sonlandırmak için 150 ml 1 M Na₂C0₃ ilave edilmiştir. Negatif kontrol olarak enzim içermeyen reaksiyon solüsyonu kullanılmıştır. Bir birim enzim aktivitesi, dakikada 1 mmol pNP salmak için gereken enzim miktarı olarak tanımlanmıştır. Substrat özgüllük analizi için, substrat olarak 1 mM pNP-β-GlcNAc, pNP-β-Gal-NAc, pNP-β-glikoz ve pNP-β-galaktoz kullanılmıştır. Standart hatalar, üç bağımsız kopyaya dayalı olarak hesaplanmıştır.

2.3. Biyokimyasal karakterizasyon

Amuc_2109’un optimum pH ve sıcaklığı, substrat olarak pNP-β-GlcNAc kullanılarak belirlenmiştir. pH tolerans analizleri için, deneysel koşullar pH tamponunun 50 mM Sitrat-Na (pH 3.0, 3.5, 4, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0), Bis-Tris-HCl (pH 6.5), Tris-HCl (pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5) veya Bisin-Na (pH 9.0) ile değiştirilmesi dışında Bölüm 2.2’de açıklananla aynıydı. Sıcaklık tolerans testi için deneyler, 50 mM Bis-tris-HCl (pH 6.5) ve 500 mM NaCl çözeltisinde 5 C’lik adımlarla 20 ila 80 ˚C arasındaki farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilmiştir, diğer deneysel koşullar Bölüm 2.2’de açıklananlarla aynıdır.  

2.4. Kristalizasyon

Apo Amuc_2109 kristalleri; kristalizasyon tamponunda (500 mM NaCl ve 50 mM Tris-HCl, pH 7.0) 2 M NaCl ve 0.1 M HEPES (pH 7.5) ve protein solüsyonu (10 mg/ml) içeren eşit hacimlerde rezervuar tamponu karıştırılarak birleşim damla buhar difüzyon yöntemi kullanılarak 16 ˚C’de büyütülmüştür. Amuc_2109-GlcNac kompleksinin kristalleri, apo Amuc_2109 kristallerinin 2 mM GlcNAc içeren rezervuar solüsyonlarında 1 saat bekletilmesiyle elde edilmiştir. Kristaller %10 (h/h) gliserol içeren rezervuar solüsyonunda birkaç saniye bekletilerek ve X-ışını kırınımı verisi toplanmadan önce sıvı nitrojen içinde flaşla dondurularak korunmuştur. 

2.5. Kristalografik veri toplama ve yapı belirleme

Amuc_2109 ve Amuc_2109-Glc-NAc kompleksinin X-ray kırınım verileri, Dectris PILATUS 6 M detektörü kullanılarak 0.9785 Å dalga boyunda Shanghai Synchrotron Radiation Facility’nin (SSRF) ışın hüzmesi yolu BL19U1’de [25] toplanmış ve HKL3000 yazılımı [26] kullanılarak işlenmiştir. Kristaller, P2₁2₁2₁ uzay grubuna aittir. Yapılar arama modeli olarak RmNag (PDB kodu 4ZM6) yapısı kullanılarak MORDA [27] yazılımı kullanılarak moleküler değiştirme yöntemiyle çözülmüştür. Modeller PHENIX [28] ve COOT [29] ile yeniden oluşturulmuş ve PHENIX ile saflaştırılmıştır. Amuc_2109 ve Amuc_2109-GlcNAc kompleksinin atomik koordinatları ve yapı faktörleri, sırasıyla 7VI6 ve 7VI7 erişim numaraları altında Protein Veri Bankasına (PDB) kaydedilmiştir. Veri toplama ve saflaştırma istatistikleri Tablo 1’de gösterilmektedir.

3. Sonuçlar

3.1. Amuc_2109, GlcNAc’ye özgü bir glikozidazdır

E. Coli’de tam uzunluktaki Amuc_2109 proteinini aşırı eksprese edilmiş ve nikel kolon afinite kromatografisi ve boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Amuc_2109’un substrat özgüllüğünü araştırmak için; enzim aktivitelerini değerlendirmek için pNP-β-GlcNAc, pNP-β-GalNAc, pNP-β-glikoz ve pNP-β-galaktoz dahil olmak üzere birkaç farklı substrat kullanılmıştır (Şekil 1A).

Şekil 1. Amuc_2109’un biyokimyasal özellikleri. (A) çeşitli kromojenik substratlara karşı Amuc_2109 aktivitesi; (B) Amuc_2109’un pH-bağımlılığı; (C) Amuc_2109’un çeşitli sıcaklıklarda nispi aktivitesi.

Amuc_2109, pNP-β-GlcNAc ve pNP-β-GalNAc’ye karşı hidrolitik aktivite sergilemiş ve burada pNP-β-GlcNAc (28.8 ± 0.6 U/mg) üzerindeki spesifik aktivite, pNP-β-GalNAc (2.5 ± 0.3 U/mg) üzerindekinden yaklaşık 10 kat daha yüksekti. Buna karşılık Amuc_2109; ne pNP-β-Glc’yi ne de pNP-β-Gal’i hidrolize edememiştir, fakat N-asetil grubu teorik olarak GH3 ailesi glikozidazlarının katalizi için gerekli değildir. Bu sonuçlar, pNP-β-GlcNac’ın Amuc_2109’un tercih edilen substratı olduğunu ve Amuc_2109’un GlcNac’a özgü bir glikozit hidrolaz olduğunu göstermiştir.

3.2. Amuc_2109’un biyokimyasal karakterizasyonu

Reaksiyon çözeltisinin pH’ını 3.0 ila 9.0 arasında değiştirerek pH toleransı incelenmiştir. Sonuçlar; Amuc_2109’un optimum pH’ının, Bacillus subtilis’ten [30] bir GH ailesi 3 β-N-asetilglukozaminidaz olan BsNag’ınkine (optimal pH aralığı 5.8-6.2) benzer şekilde 6.0-6.5 civarında olduğunu göstermiştir. Amuc_2109, pH 4.5-5.5 ve pH 7.0-8.0’da %20-%40 aktiviteye sahipti ve 8.0’dan daha yüksek pH’ta bir miktar aktivite olarak kaldı, ancak pH 4.0 ve altında inaktifti (Şekil 1B). A. muciniphila’dan elde edilen diğer β-N-asetilglukosaminidazlarla karşılaştırıldığında Amuc_2109’un pH aktivite profili, Amuc_0868 [22] ve Amuc_2136’dan [23] önemli ölçüde daha dardı; oysa onun optimum pH’sı, yaklaşık 5.0 olan Amuc_2108’den önemli ölçüde daha yüksekti [31]. Bu çalışmada Amuc_2109’un katalitik aktiviteleri 20 ila 80 ˚C arasındaki farklı sıcaklıklarda analiz edilmiş ve Amuc_2109’un 55 ˚C’de en yüksek aktiviteyi gösterdiği bulunmuştur. O; 70°C’nin üzerindeki veya 30°C’nin altındaki sıcaklıklarda enzim aktivitesinin %70 veya daha fazlasını kaybederken 40-65 ˚C aralığında %70 ve üzeri aktiviteyi sürdürmektedir. Amuc_2109’un optimum sıcaklığı ve onun tolere edilebilir sıcaklık aralığı; Amuc_0868, Amuc_2018 ve Amuc_2136’nınkinden önemli ölçüde daha yüksekti. Deneysel sonuçlarımızın, belirli sıcaklıklarda yalnızca 10 dakikalık reaksiyon için olduğu ve verilerimizden Amuc_2109’un 55 ˚C veya daha yüksek sıcaklıklarda kararlı bir şekilde yüksek aktivite sergileyebileceği sonucuna varılamayacağı belirtilmelidir.

3.3. Amuc_2109’un genel yapısı

β-N-asetilglukozaminidazın katalitik mekanizmasını aydınlatmak için, Amuc_2109’un yapısı moleküler ikame yöntemini kullanarak çözülmüş ve 2.0 Å çözünürlüğe saflaştırılmıştır. Kristaller, a=78.93 Å, b=81.11 Å, c=126.99 Å ve α = β = γ = 90° hücre parametreleri ile P2₁2₁2₁ uzay grubuna aitti ve nihai model, 0.184/0.225’in R_work/R_free değerlerine rafine edilmiştir (Tablo 1). Nihai atomik model, 1-338 amino asit kalıntılarından oluşmaktadır. Amuc_2109, sekiz α-helisle çevrelenmiş merkezi bir sekiz şeritli paralel β-barrel’den oluşan ve birçok glikozid hidrolaz arasında yaygın olan kanonik (α/β)₈ TIM-barrel katını (Şekil 2A) benimser. Amuc_2109 TIM barrel yapısı, tam bir 8 β-şerit ve 8 sarmal seti içerir; burada sarmal 6’nın C-ucu geleneksel bir α-sarmal değil, bir π-sarmaldır. β3 ile α3 arasına ve β5 ile α5 arasına iki sarmal yerleştirilir ve sırasıyla α3′ ve α5′ olarak adlandırılır. β3 ile α3′, β4 ile α4 ve β5 ile α5′ arasında uzun döngüler vardır. β4-α4 döngüsünün ve β5-α5′ döngüsünün β-faktörleri, diğer bölgelerinkinden önemli ölçüde daha yüksektir (Şekil S1), bu durum bu iki döngünün büyük olasılıkla esnek olduğunu düşündürmektedir. Amuc_2109’un C-ucunda iki tane daha uzun sarmal, α9 ve α10 vardır. α9, merkezi β-barrelin N-ucunun karşısında bulunur; α10 ise, α3 ile birliktedir.

Şekil 2. Amuc_2109’un kristal yapısı. (A) apo Amuc_2109’un genel yapısı, ikincil yapıları etiketlenmiş gökkuşağı renkli bir çizgi dizi olarak gösterilmiştir. (B) GlcNAc bağlı Amuc_2109’un genel yapısı. Amuc_2109 ve GlcNAc (NAG), sırasıyla gökkuşağı renkli çizgi dizi ve sarı çubuklar olarak gösterilmiştir. (C) Amuc_2109-GlcNAc etkileşimlerinin ayrıntılı görünümleri. GlsNAc ile temas eden Amuc_2109 kalıntıları yeşil çubuklar olarak gösterilmiştir; GlcNAc sarı çubuklar olarak gösterilmiştir. Hidrojen bağları eflatun renkli kesikli çizgilerle gösterilmiştir. GlcNAc’nin simüle edilmiş tavlama hariç bırakılan haritası (Fo-Fc 3.5 s’de konturlu) gri ağlar olarak gösterilmiştir. (D) Amuc_2109’un GlcNAc-bağlanma cebi. GlcNAc, sarı çubuklar olarak gösterilmiştir; Amuc_2109, elektrostatik potansiyel tarafından renklendirilmiş yüzey olarak gösterilmiştir. (Bu şekil açıklamasında renk referanslarının yorumlanması için okuyucu bu makalenin Web versiyonuna yönlendirilir.)

Amuc_2109’un genel yapısı, Bacillus subtilis’ten (BsNagZ, PDB kodu 3BMX) [30] (%33 dizi benzerliği, 195 kalıntının üst üste getirilmesine dayalı olarak 1.05 Å’nın Ca RMSD) iki alanlı NagZ’nin ve Salmonella typhimurium’dan (StNagZ, PDB kodu 4GVG) [32] (%34 dizi benzerliği, 200 kalıntının üst üste getirilmesine dayalı olarak 1.15 Å’nın Ca RMSD) tek alanlı NagZ’nin TIM barrel bölgelerine benzerdir. Bu proteinlerin merkezi β-barrel iyi bir şekilde üst üste getirilebilirken, periferik sarmallarda ve C-uç sarmallarında bazı önemli farklılıklar bulunmaktadır (Şekil S2).

3.4. GlcNAC tanımlamalarının yapısal detayları

Amuc_2109’un GlcNAc’ye bağlanma mekanizmasını belirlemek için, apo kristallerini GlcNAc içinde beklettik ve 2.0 Å çözünürlükte Amuc_2109-GlcNAc kompleksinin yapısını çözdük (Şekil 2B). GlcNAc molekülleri, berrak elektron yoğunluklarına göre belirlenmiştir (Şekil 2C). Nihai modelin R_work ve R_free sırasıyla 0.180 ve 0.216’ya saflaştırılmıştır (Tablo 1). Aktif bölgede GlcNAc’nin bağlanması üzerine Amuc_2109’un yapısında apo yapısı ile karşılaştırıldığında anlamlı bir değişiklik yoktur (Şekil S3). GlcNAc, merkezi β-barrelin C-ucunda ağırlıklı olarak yüklü amino asitlerden oluşan bir cebe bağlanır (Şekil 2B, C ve D). Substrat bağlanma cebi, Asp62, Arg132, Lys162, His163, Asp246 ve Asp247 kalıntıları tarafından çevrilidir. GlcNAc’nin hidroksil grupları ve asetilamino grubu, bu kalıntılarla çok sayıda hidrojen bağı oluşturur. Asp62’nin yan zincir karboksil grubu, GlcNAc’nin O4 ve O6’sı ile iki hidrojen bağı oluşturur. His163’ün yan zinciri, O3 ile bir hidrojen bağı oluşturur ve Lys162’nin yan zincir aminosu, GlcNAc’nin O4 ve O3’ü ile iki hidrojen bağı oluşturur. Arg132’nin bir ω-aminosu, O3 ile bir hidrojen bağı oluştururken, diğer ω-amino, GlcNAc’nin asetil grubu ile bir hidrojen bağı oluşturur. Asp246’nın yan zincir karboksil grubu, GlcNAc’nin N2 ve O1’i ile bir hidrojen bağı oluştururken, Asp247’nin ana zincir aminosu da O1 ile bir hidrojen bağı oluşturur. Hidrojen bağı ağı, substratı Amuc_­­­­­­­­­­­­­2109’un aktif bölgesinde kilitler (Şekil 2C).

4. Tartışma

Bu çalışmada, A. muciniphila’dan Amuc_2109’un GlcNAc’ye özgü bir glikozidaz olduğunu belirledik. Enzimatik sonuçlarımız, Amuc_2109’un nötr ila asidik koşullar altında en yüksek aktiviteyi sergilediğini ve 4.5 ila 8.0 pH aralığında en yüksek aktivitenin %20’sinden fazlasını koruduğunu göstermiştir. Amuc_2109’un pH’a dayanıklı özelliği, insan bağırsağının pH ortamına uyum sağlamasına olanak tanır [33]. Ayrıca Amuc_2109, yalnızca bağırsak ortamına uyum sağlamakla kalmayıp aynı zamanda endüstriyel uygulamalar için potansiyele sahip olan etkileyici sıcaklık toleransı da sergiler. 

Yapı sonucumuz, tipik bir (α/β)₈ TIM barrel yapısına sahip tek alanlı bir GH3 ailesi glikozidazı olan Amuc_2109’un ayrıntılı yapısal özellikleri hakkında bilgi sağlamıştır. GlcNAc ile Asp62, Arg132, Lys162, His163 ve Asp246’nın yan zincirleri tarafından oluşturulan birkaç hidrojen bağı, Amuc_2109’un substrat özgüllüğünü belirler. Özellikle, Arg132’nin ω-amino grubu ile GlcNAc’nin karbonil grubu arasındaki etkileşim Amuc_2109’un sadece N-asetilamino şekerlerine karşı aktif olmasını sağlar. 

Gram-negatif bakterilerden elde edilen GH3-tipi β-N-asetilglukozaminidazlar tipik olarak StNagZ [32] ve Vibrio cholerae’den (VcNagZ) [34] NagZ gibi tek bir TIM barrel bölgesi [34,35] içerir. BsNagZ’nin [30] iki bölgeye sahip olmasına rağmen, onun C-uç bölgesi N-uç TIM-barrel yapısından uzaktır ve katalitik aktiviteye katkıda bulunmaz. GH3 ailesi β-N-asetilglukosaminidazlar, β5’te ve β5-α5 döngüsünün N-ucunda yer alan oldukça korunmuş bir motif [KH(F/I)PG(H/L)GXXXXD(S/T)H] ile karakterize edilir. Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar, bu motifin N-ucundaki lizin ve histidinin doğrudan substrat bağlanmasına dahil olduğunu ortaya çıkarmış; oysa C-ucundaki aspartik asit ve histidin ise, histidinin aspartik asit ile bir hidrojen bağı yardımıyla bir asit/baz katalizörü gibi davrandığı bir katalitik Asp-His ikilisi oluşturmuştur [30,36]. Dizi sıralama analizi Amuc_2109’un, H/L bölgesinde bir metiyonin ve S/T bölgesinde bir prolin dışında, korunmuş amino asit dizisini (Lys162’den His176’ya) içerdiğini ortaya çıkarmıştır (Şekil S4), Amuc_2109’un benzer bir katalitik mekanizmaya sahip olabileceğini düşündürmektedir. Karmaşık yapımızda; Lys162 ve His163 substrat ile hidrojen bağları oluşturur (Şekil 2C). Bununla birlikte, Asp-His ikilisinin karşılık gelen kalıntıları Asp173 ve His175, substrat ile etkileşime girmez (Şekil 3A ve B). Muhtemel sebeplerden biri, kompleks yapımızın apo kristalin substrata batırarak elde edilmiş olması ve kristal paketinin, GH3 ailesi β-N-asetilglukozaminidazların katalitik sürecinde yaygın olan β5-α5 döngüsünün konformasyonel değişimini bloke edebilmesi olabilir [37]. Asp-His ikilisinin substrattan bu şekilde ayrılması, StNagZ-GlcNAc kompleksi [32] (Şekil 3A ve B) gibi kristala daldırma yöntemiyle elde edilen GH3 ailesi β-N-asetilglukozaminidaz-substrat komplekslerinin diğer yapılarında da gözlemlenir. Bu nedenle, Amuc_2109’un kristal yapısındaki yüksek B faktörü nedeniyle esnek olduğu düşünülen Amuc_2109’un β5-α5 döngüsünün (Şekil S1), katalitik işlem sırasında da konformasyonel değişikliğe uğraması beklenebilir. Bununla birlikte, S/T’nin daha az esnek bir prolin ile ikame edilmesinin, Amuc_2109’daki Asp-His ikilisinin konformasyonel değişikliğin farklı bir özelliği ile sonuçlanabileceğine dikkat edilmelidir.

Şekil 3. Amuc_2109-GlcNAc’nin diğer GH3 β-N-asetilglukozaminidazlarla yapısal karşılaştırılması. (A) Amuc_2109-GlcNAc yapısının BsNagZ-PUGNAc (PDB kodu 3NVD) ve StNagZ-GlcNAc (PDB kodu 4GVF) yapılarıyla üst üste bindirilmesi. Amuc_2109, BtNagZ ve StNagZ yeşil, gri ve pembe çizgi diziler olarak gösterilmiştir. Amuc_2109’a bağlı GlcNAc, BtNagZ’ye bağlı PUGNAc ve StNagZ’ye bağlı GlcNAc; sarı, gri ve pembe çubuklar olarak gösterilmiştir. (B) Substrat bağlama ve β5-α5 döngü bölgelerinin büyütülmüş görünümü. Her yapıdaki Asp-His katalitik ikili kalıntıları çubuklar halinde gösterilmiştir. (Bu şekil açıklamasında renk referanslarının yorumlanması için okuyucu bu makalenin Web versiyonuna yönlendirilir.)

Bağırsak mikrobiyotası insan hastalıkları ve sağlığı ile yakından ilişkilidir. Bununla birlikte, büyük ölçüde ilgili bakteriyel proteinlerin enzimatik ve yapısal verilerinin eksikliğinden dolayı, bu faydalı etkilerin altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. A. muciniphila tarafından eksprese edilen β-N-asetilheksosaminidaz, mukus tabakasının dinamik homeostazını korumada hayati roller oynar. Bağırsak bakterisi A. muciniphila’dan tanımlanan bir GH3 glikozidazın şimdiye kadarki ilk yapısal çalışması olan bu çalışma, Amuc_2109’un substrat özgüllüğü ve seçiciliğinin ayrıntılı bir şekilde araştırılması için yapısal bir temel sağlar ve sonuçlarımız, GH ailesi 3 glikosidazlarının katalitik mekanizmasını anlamak için yararlı olmalıdır. Ancak A. muciniphila tarafından müsinin parçalanmasında Amuc_2109’un rolünün daha fazla doğrulanması gerekmektedir.