Monosodyum glutamat tüketimi, trimetilamin N-oksid’in renal atılımını ve bağırsakta Akkermansia muciniphila bolluğunu azaltır
ÖZET
Daha önce monosodyum glutamat (MSG) tüketiminin böbrek dokusundaki trimetilamin (TMA) seviyesini ve ayrıca sıçanların idrarındaki dimetilamin ve metilamin seviyelerini arttırdığını göstermiştik, bu da MSG’nin insanlar üzerindeki etkilerini düşündürmektedir. Bulguları daha iyi tanımlamak için sıçan modelinde MSG tüketiminin, serum trimetilamin N-oksit (TMAO) seviyesini değiştirip değiştirmediği ve bunun sonucunda böbrek hasarına neden olup olmadığı araştırılmıştır. Yetişkin erkek Wistar sıçanları (n = 40), standart bir diyetle (kontrol grubu) ve sırasıyla 60 kg erkekte günde 7, 21 veya 42 g’a karşılık gelen % 0.5, 1.5 ve 3.0 g MSG içeren içme suyunda standart bir diyetle (MSG uygulanan gruplar) ve 4 hafta sonra bırakılan % 3.0 g MSG içeren içme suyunda standart bir diyetle (MSG’yi bırakma grubu) beslenmek üzere rastgele seçilmiştir. 1H NMR ve böbrek hasarı belirteçleri kullanılarak TMAO seviyelerini analiz etmek için kan ve idrar örnekleri toplanmıştır. Bağırsak mikrobiyota analizi için dışkı örnekleri de toplanmıştır. MSG’nin kesilmesiyle çöken nötrofil jelatinaz ilişkili lipokalin (NGAL) atılımındaki artışa paralel olarak MSG tüketimi sırasında serum TMAO seviyelerinin arttığı ve idrar TMAO atılımının azaldığı bulunmuştur. MSG tüketimi sırasında fekal 16 S rRNA analizi, müsin üreten bir bakteri olan Akkermansia muciniphila’nın kalıcı bir şekilde baskılanmasıyla birlikte bağırsak mikrobiyota değişiklikleri göstermiş, ancak TMA üreten bakterilerde değişiklik görülmemiştir. Sonuç olarak, bulgularımız uzun süreli yüksek doz MSG tüketiminin akut böbrek hasarı ile ilişkili renal atılımı azaltarak kanda TMAO birikimine neden olabileceğini düşündürmektedir. MSG’nin TMAO atılımını azalttığı mekanizmalar daha fazla araştırma gerektirmektedir.
1. Giriş
Monosodyum glutamat (MSG), lezzet arttırıcı olarak tüm dünyada geniş bir alanda kullanılan yaygın bir gıda katkı maddesidir ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından genel olarak güvenli olarak kabul edilen bir kategoride listelenmiştir [1]. Bununla birlikte, bizim grubumuzdan ve diğerlerinden alınan verilere dayanarak MSG tüketiminin kilo alımı [2,3], hipertansiyon [4] ve metabolik sendrom [5] dahil olmak üzere metabolik bozukluklar üzerindeki etkileri hakkında sorular artmıştır. Bu gözlemler başkaları tarafından tümüyle tekrarlanmamıştır [6,7]. Bu nedenle, MSG eklenmiş standart bir diyetle beslenen yetişkin erkek Wistar sıçanları gibi belirlenmiş hayvan modellerini kullanan mekanik çalışmalara ihtiyaç vardır.
Uzun süreli MSG tüketimi, proteomik analiz [9] tarafından gözlemlenen renal oksidatif stres ile böbrek yapısal ve fonksiyonel değişikliklere ve elektrolit dengesizliğine [8] neden olur. Kısa bir süre MSG verilen hayvanlarda, MSG’nin karaciğer ve böbrek metabolik yollarını bozan alkalileştirici bir ajan [10] olduğu ve idrarda dimetilamin ve (mono)metilamin yükselmesine ve böbrek dokusunda trimetilamin (TMA) yükselmesine neden olduğu gösterilmiştir [11]. TMA; diyetle alınan karnitin, kolin ve kolin içeren bileşiklerden bağırsak lümeninde TMA üreten bakteriler [12], özellikle Firmicutes ve Proteobacteria filumları [13] tarafından üretilen üçüncül bir alifatik amindir. TMA’nın kararlı bir ürünü olan trimetilamin N-oksit (TMAO); TMAO üretimi [16] veya hemodiyaliz [17] inhibisyonu ile önlenen tubulointerstisyel fibroz ve kollajen birikimi [15] yoluyla özellikle kalpte [14] ve böbrekte hasara neden olabilir. Bu gözlemlere dayanarak; böbrek hasarını, serum, idrar ve böbrek dokusundaki TMAO seviyelerini ve ayrıca TMA üreten bağırsak bakterileri ile bağlantılı MSG ile ilişkili değişikliklerin kanıtlarını aradık.
2. Materyal ve metotlar
2.1. Kimyasallar ve hayvanlar
Çalışmada; gıdada kullanıma uygun MSG (Ajinomoto, Tokyo, Japonya), trimetilamin N-oksit (TMAO) (Sigma Aldrich, St. Louis, ABD), sodyum trimetilsilil-[2,2,3,3-2H4]-propionat (TSP) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, ABD) ve kreatinin (Sigma) Louis, ABD) dahil olmak üzere analitik sınıf kimyasallar kullanılmıştır. 13 haftalık 40 yetişkin erkek Wistar sıçanı Kuzeydoğu Laboratuar Hayvanları Merkezi (NELAC), Khon Kaen Üniversitesinden temin edilmiş ve deneyden önce ortama alıştırılmıştır. Sıçanlar, 23 ± 2 °C’de tutulan ve nem oranı %30-60 olan ve 12 saat aydınlık/karanlık döngüsü olan bir hayvan odasında ayrı ayrı barındırılmıştır. Çalışma, Tayland Ulusal Araştırma Konseyi Hayvan Deneyleri Etiği (IACUC-KKU-92/64) uyarınca Khon Kaen Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
2.2. Hayvan çalışması
Erişkin erkek Wistar sıçanları, standart sıçan yemi diyeti ve içme suyu ile rutin beslenmiştir ve her birinde 8 sıçan olacak şekilde beş gruba ayrılmıştır:
1) standart bir diyet ve normal içme suyu ile beslenen kontrol grubu;
2) standart bir diyet ve içme suyunda %0.5 g MSG ile beslenen düşük MSG tüketim grubu (L-MSG);
3) standart bir diyet ve %1.5 g MSG içme suyuyla beslenen orta düzeyde MSG tüketim grubu (M-MSG);
4) standart bir diyet ve içme suyunda %3.0 g MSG ile beslenen yüksek MSG tüketim grubu (H-MSG);
5) uzun vadeli ve kısa vadeli bırakma etkilerini araştırmak için arka arkaya 4 ve 2 hafta boyunca içme suyunda %3.0 g MSG içeren ve içermeyen standart bir diyetle beslenen MSG bırakma grubu (W-MSG)
İki haftada bir 24 saatlik idrar ve dışkı örneklerinin toplanması için metabolik kafesler kullanılmıştır ve örnekler analiz edilene kadar -20 °C’de depolanmıştır. Uygulamanın sonunda, sıçanlar karbondioksit inhalasyonu kullanılarak öldürülmüş, kalp delinerek kan alınmış ve böbrek parçalara ayrılmış ve H&E ve Masson’s Trichrome boyaması için %10 formalin tamponunda sabitlenmiştir.
2.3. TMAO tayini
Serum ve idrar örneklerinde TMAO; 298.1 K sıcaklıkta 400 MHz 1H Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) spektrometre (Bruker, Massachusetts, Amerika Birleşik Devletleri) kullanarak spektrumları kalibre etmek için dahili bir standart olarak TSP ve tepe noktası (δ1H = 0.00) kullanılarak belirlenmiştir. İdrar numunesindeki TMAO konsantrasyonu, SMA (basit karışım analizi), MNOVA (Mestralab Research, Bajo, İspanya) yazılımı kullanılarak hesaplanmıştır. İdrarda örtüşen taurin üçlüsü; ((I1-I2-I3)/NN1 * CCF) formülü kullanılarak çıkarılmıştır. TMAO atılımı, idrardaki TMAO konsantrasyonu ile günlük toplam idrar hacmi çarpılarak hesaplanmıştır. Serumdaki TMAO konsantrasyonu, bir yazılım qNMR, MNOVA, Mestralab kullanılarak hesaplanmıştır.
2.4. Böbrek fonksiyonunun işaretleri
Serum kreatinin; UV/Görünür spektrofotometre, Ultrospec 3100 pro (Amersham Biosciences, Uppsala, İsveç) kullanılarak Jaffe yöntemiyle [18] belirlenmiş ve kreatinin klerensi ((İdrar kreatinin konsantrasyonu X idrar hacmi)/(serum kreatinin X toplama süresi, dakika)) formülü ile hesaplanmıştır. İdrar nötrofil jelatinaz ile ilişkili lipokalin (NGAL), üreticinin talimatına göre enzim bağlantılı immünosorbent testi, Rat Lipocalin-2 ELISA kiti (Abcam, Birleşik Krallık) ile ölçülmüştür. NGAL salınımı, günlük idrar hacmi ile konsantrasyon çarpılarak hesaplanmıştır.
2.5. Böbrek histopatolojisi
Sıçan böbreklerinin parafine gömülmüş doku blokları rutin histopatoloji sistemine göre işlenmiş ve kesitler 4 mm kalınlığında dilimlenmiştir. Kesitler Haematoxylin & Eosin (H&E) ile boyanmış ve ışık mikroskobu (Primo Star, Zeiss) altında gözlemlenmiştir. Fibrozisi gözlemlemek için, böbrek kesitleri Masson’s Trichrome ile boyanmış, ScanScope slayt tarayıcı (Aperio) ile taranmış ve Aperio ImageScope Version 12.Mart 4, 5008 kullanılarak yorumlanmıştır.
2.6. Bağırsak mikrobiyota analizi
Üreticinin talimatlarına göre QiAamp Power Fecal Pro DNA Kiti (Qiagen, Hilden, Almanya) kullanılarak bakteriyel genomik DNA ekstrakte edilmiştir. Ayrıştırılan DNA, 16S ribozomal RNA (rRNA) gen dizilemesi için kullanılmıştır. Genomik DNA’nın miktarı ve kalitesi, bir Nanodrop 2000c spektrofotometre (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD) ve agaroz jel elektroforezi ile ölçülerek kontrol edilmiştir. Her bir genomik DNA numunesi için, 16 S rRNA geni, primerler kullanılarak V3-V4’ün değişken bölgesini hedefleyerek amplifiye edilmiştir: ön primer: V3 (5’ TCGTCG GCAG CGTCAGATGTG TATAAGAGAC ACCTACGGG NGGCWGCAG) ve arka primer V4 (5’GTCTCGTGG GCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACH VGGGT ATCTA ATCC). 16 S rRNA dizileme kütüphanesi hazırlanmış ve çift uçlu okumaları birleştirmek için FLASH (1.2.11) (http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/, erişim tarihi: 3 Nisan 2021) kullanılmıştır. Ham okumaları filtrelemek ve kırpmak, hatasız okumaları seçmek ve kümeleme yapmak için CD-HIT-OTU (http://weizhongli-lab.org/cd-hitotu/, erişim tarihi 3 Nisan 2021) ve rDNA Araçları kullanılmıştır. %100 benzerliğe dayalı olarak, %97 eşik özdeşliği ile OTU’ların (Operasyonel Taksonomik Birimler) sınıflandırılması için QIIME-UCLUST dizilemesi gerçekleştirilmiştir. Dizilerin ≥97% benzerliğinin paylaşılması, aynı OTU olarak ayarlanmıştır. Temsili OTU dizilerinin hizalanması için Ribozomal Veritabanı Projesi (RDP) kullanılmış ve taksonominin sınıflandırılması için referans NCBI veritabanları kullanılmış ve karşılaştırılmıştır. Mikrobiyal Ekolojiye Kantitatif Anlayış (QIIME); krallık, filum, sınıf, takım, aile, cins ve türler olmak üzere çeşitli taksonomik seviyelerde okumaların bir sınıflandırmasının çıktısı için kullanılmıştır.
2.7. İstatistiksel analiz
Sürekli değişkenler, ortalama ± ortalamanın standart hatası (SEM) olarak ifade edilir. Dört grup arasındaki verilerin karşılaştırılması için post-hoc LSD testi ile tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılmıştır. MSG uygulaması öncesi ve sonrası verilerin karşılaştırılmasında Wilcoxon işaretli sıra testi kullanılmıştır. Anlamlılık düzeyi p < 0.05 olarak kabul edilmiştir. Analizler, GraphPad Prism sürüm 9.31 (GraphPad Software, La Jolla, CA, ABD) ve Windows için IBM SPSS (sürüm 22, SPSS Inc., Chicago, IL, ABD) kullanılarak gösterilmiştir.
3. Sonuçlar
3.1. MSG su alımını ve idrar çıkışını artırır
Deney boyunca, gıda ve su alımı günlük olarak bireysel olarak kaydedilmiş ve vücut ağırlığı ve idrar hacmi iki haftada bir izlenmiştir. Kontrol grubundan bir sıçan, deney sırasında bir hastalık nedeniyle çalışma dışı bırakılmıştır. MSG’nin gıda alımı, vücut ağırlığı, su alımı ve idrar çıkışı üzerindeki etkileri Şekil 1’de özetlenmiştir. MSG tüketimi, beş grup arasında gıda alımı (Şekil 1A) ve vücut ağırlığı üzerinde belirgin bir etki göstermemiştir (Şekil 1B). Bununla birlikte, MSG tüketiminin su alımında artışa (Şekil 1C) ve buna bağlı olarak idrar çıkışında artışa (Şekil 1D) neden olduğu gözlemlenmiştir.
Şekil 1. Deneyin 12 haftası boyunca çeşitli zaman noktalarında MSG tüketiminin; sıçanların gıda alımı (A), vücut ağırlığı (B), su alımı (C), idrar çıkışı (D) üzerindeki etkileri. Veriler, ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir ve p-değerleri, post-hoc LSD testleri (*p < 0.05) ile tek yönlü ANOVA ile hesaplanmıştır. Kontrol grubu (n = 7), L-MSG grubu (n = 8), M-MSG grubu (n = 8), HMSG grubu (n = 8), W-MSG grubu (n = 8).
3.2. MSG serum TMAO seviyesini arttırır ve idrar TMAO atılımını azaltır
MSG tüketiminin serum TMAO düzeylerini etkileyip etkilemediğini araştırmak için serum ve idrar TMAO ölçülmüş ve sonuçlar Şekil 2’de özetlenmiştir. H-MSG grubu, 4. haftada diğer gruplara kıyasla önemli ölçüde daha yüksek serum TMAO seviyeleri göstermiş (Şekil 2A) ve istatistiksel olarak anlamlı olmasa da, aynı eğilim 12. haftada gözlemlenmiştir (Şekil 2C). Serum TMAO düzeyindeki artış, diğer gruplarla karşılaştırıldığında nispeten H-MSG grubunda daha düşük olan idrarda TMAO atılımının azalmasına karşılık gelmiştir (Şekil 2B ve D). Daha sonra, MSG bırakma grubunun serum ve idrar TMAO seviyeleri, aynı yaştaki hayvanlara karşılık gelen aynı zaman noktasında kontrol ve H-MSG grupları ile karşılaştırılmıştır. H-MSG grubunun serum TMAO seviyeleri, MSG bırakma grubuna kıyasla nispeten daha yüksekti ve 4. ve 12. haftalarda istatistiksel olarak anlamlı hale gelmiştir (Şekil 2E). Bu sonuçlar, H-MSG grubundaki TMAO atılımının, MSG bırakma grubuna kıyasla azalmasına karşılık gelmektedir (Şekil 2F).
Şekil 2. MSG tüketiminin dört sıçan grubu arasında 4. haftada serum (A), idrarda (B) ve 12. haftada serum (C) ve idrarda (D), TMAO seviyeleri üzerindeki doz ve zaman yanıtları. Deneyin 0, 4, 8, 12. haftalarında serum (E) ve idrar (F) TMAO seviyeleri üzerinde MSG tüketiminin bırakma etkileri. Veriler, ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir ve p-değerleri, post-hoc LSD testleri (*p < 0.05) ile tek yönlü ANOVA ile hesaplanmıştır. Kontrol grubu (n = 7), L-MSG grubu (n = 8), M-MSG grubu (n = 8), H-MSG grubu (n = 8), W-MSG grubu (n = 8).
3.3. MSG akut böbrek hasarına neden olur
MSG takviyesinin böbrek üzerindeki etkileri, böbrek dokularının histopatolojisi (H&E, Masson’s Trichrome), böbrek ağırlığı, serum kreatinin, kreatinin klirensi ve NGAL salınımı karşılaştırılarak incelenmiştir. Histopatolojik incelemede tüm gruplarda kılcal damarlarda kırmızı kan hücreleri ile tıkanmış glomerüller, vasküler konjesyon, tübüllerde sitoplazmik vakuolasyon, perivasküler dilatasyon, mezangial hiperselülarite görülmüştür. Kontrol ve MSG uygulanan hayvanlar arasında anlamlı bir değişiklik görülmemiştir (Şekil 3A-D). Masson’un Trichrome boyaması kullanılarak, kontrol (Şekil 3E) ve MSG uygulanan grup (Şekil 3F) arasında tubulointerstisyel fibroziste anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir. Bununla birlikte, H-MSG grubunda kontrollerde nadiren gözlemlenen renal tübüllerin interstisyel boşluğunda mononükleer inflamatuar hücrelerin infiltrasyonu gözlemlenmiştir.
Şekil 3. 12 haftalık deney hayvanlarında böbrek bölümlerinin H&E ve trikrom boyaması (20x). Kontrol (A) ve H-MSG grubu (B, C, D) arasında anlamlı bir değişiklik gözlemlenmemiştir. Kontrol (E) ve H-MSG grubu (F) hayvanları arasında interstisyel fibroz açısından önemli bir fark görülmemiştir. Kontrole kıyasla H-MSG grubunda renal tübüllerin interstisyel boşluğunda belirgin mononükleer inflamatuar hücre infiltrasyonu (kırmızı ok) gözlemlenmiştir. (Bu şekil açıklamasında renk referanslarının yorumlanması için okuyucu bu makalenin Web versiyonuna yönlendirilir.)
Ayrıca H-MSG grubu; kontrol grubu (p=0.001) veya L-MSG grubu (p=0.012) ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak daha yüksek böbrek ağırlığına sahipti (Şekil 4A). Dört grup arasında kreatinin klirens değerlerinde paralel bir fark olmaksızın, kontrol grubu (p=0.038) veya M-MSG grubu (p=0.032) (Şekil 4B) ile karşılaştırıldığında H-MSG grubunda serum kreatin anlamlı olarak yüksekti (Şekil 4C). MSG uygulanan gruplarda NGAL salınımı; L-MSG, M-MSG ve H-MSG, kontrol grubuyla kıyaslandığında nispeten daha yüksekti ancak istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (Şekil 4D). Farklı zaman noktalarında (0, 4, 8, 10 ve 12. hafta; Şekil 4E) MSG bırakılan hayvanlarda MSG’nin böbrek hasarı üzerindeki bırakma etkisi büyük ölçüde belinmiştir. NGAL salınımının, MSG uygulanan haftalarda (4. ve 10. haftalar) MSG uygulanmayan haftalara (0, 8 ve 12. haftalar) kıyasla anlamlı derecede daha yüksek olduğu bulunmuştur.
Şekil 4. 12 haftada, sıçanların dört grubu arasında böbrek ağırlığı (A), serum kreatinin (B), kreatinin klirensi (C) ve NGAL salınımı (D) dahil ve çalışmanın 12 haftası boyunca farklı zaman noktalarında MSG bırakan grupta NGAL salınımını (E) içeren böbrek hasarı belirteçleri. Veriler, ortalama ± SEM olarak gösterilmiş ve p-değerleri, post-hoc LSD testleri (*p < 0.05) ile tek yönlü ANOVA ile hesaplanmıştır. Kontrol grubu (n = 7), L-MSG grubu (n = 8), M-MSG grubu (n = 8), H-MSG grubu (n = 8).
3.4. Bağırsak mikrobiyota analizi
MSG tüketiminin bağırsak mikrobiyota değişiklikleri üzerindeki etkilerini belirlemek için, çeşitli zaman noktalarında MSG bırakan sıçanlardan alınan dışkı numuneleri üzerinde 16 S rRNA dizilimi gerçekleştirilmiş ve toplamda 8 filum, 17 sınıf, 23 takım, 47 familya, 133 cins ve 202 bakteri türü gözlemlenmiştir (Şekil 5). En fazla bulunan filum Firmicutes (%68.46), ardından Bacteroides (%26.72) ve Verrucomicrobia (%1.51) idi. Filum düzeyinde, Firmicutes ve Verrucomicrobia zıt yönde de olsa MSG ile en geniş değişiklikleri göstermiştir (Şekil 5A). Aslında, MSG tüketiminden sonra Firmicutes artarken (p=0.043), Verrucomicrobia ise MSG bırakılan haftalarına göre anlamlı bir şekilde azalmıştır (p=0.028). Sınıf seviyesinde Bacilli, Clostridia ve Erysipelotrichia (Firmicutes arasında); Bacteroidia (Bacteroides arasında) ve Verrucomicrobiae (Verrucomicrobia arasında) MSG takviyesi sırasında artan Bacilli ve azalan Erysipelotrichia ile popülasyonda (Şekil 5B) bol miktarda bulunuyordu. MSG uygulaması sırasında cins düzeyinde Lactobacilli ve Limosilactobacilli artarken (Şekil 5E) takım ve familya seviyelerinde (Şekil 5C-D) benzer eğilimler gözlemlenmiş ve Lactobacillus intestinalis türü için istatistiksel farka ulaşılmıştır (Şekil 5F).
Şekil 5. MSG bırakan grubun (n = 6) dışkı örneklerinde çeşitli düzeylerde göreceli operasyonel taksonomik birim (OTU) bolluğu ısı haritası ile gösterilmiştir. Renk anahtarı, her bir ifade düzeyinde bağırsak mikrobiyotasındaki göreceli bolluk yüzdesine karşılık gelmekte ve * önemli değişikliği göstermektedir. 1,2,3,4,5,6,7,8 karşılık gelen filumu temsil etmektedir. (Bu şekil açıklamasında renk referanslarının yorumlanması için okuyucu bu makalenin Web versiyonuna yönlendirilir.)
MSG uygulamasına filumdan başlayarak tür seviyelerine kadar Verrucomicrobia bolluğunun önemli ölçüde bastırılması (p=0.028) eşlik ederken, MSG ile Bacteroides filumu için tür düzeyinde anlamlı bir değişiklik gözlemlenmemiştir. Tür düzeyinde, Lactobacillus intestinalis ve Akkermansia muciniphila, Şekil 6’da gösterildiği gibi MSG takviyesiyle değişmiştir. Dikkate değer bir şekilde TMA üreten bakterilerde MSG tüketimi ile ilişkili anlamlı bir değişiklik yoktur.
Şekil 6. MSG bırakan grubun (n = 6) dışkı örneklerinde tür seviyelerinde göreli işlevsel taksonomik birim (OTU) bolluğu. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilmiş ve p değerleri Wilcoxon işaretli sıralama testi (*p < 0.05) tarafından hesaplanmıştır.
4. Tartışma
Daha önce grubumuz ve diğerleri tarafından iddia edildiği gibi, MSG’nin TMAO yolakları aracılığıyla böbrek fonksiyonunu etkilediği mekanizmaların anlaşılması potansiyel klinik açıdan önemlidir [11,19]. Bu alanı araştırmak için, belirlenmiş hayvan modeli beş deneysel koşul ile, yani sürekli ve aralıklı (bırakma) bir MSG takviyesi ve bir kontrol standart diyet ile oluşturulmuştur. Kısaca bu çalışma verileri; diyetle alınan MSG’nin su alımını ve idrar çıkışını artırdığını, TMAO atılımını inhibe ederken serum TMAO’yu arttırdığını, akut böbrek hasarına neden olduğunu ve bağırsak bariyeri bütünlüğünü koruduğu bilinen Akkermansia muciniphila’nın bolluğunu azalttığını göstermiştir. Bu dört gözlem daha ayrıntılı olarak tartışılacaktır.
Birinci gözlem; gıda alımını değiştirmemekle birlikte MSG daha yüksek ve tutarlı su alımı ve idrar çıkışı ile ilişkiliydi (Şekil 1), önceki çalışmalarla [8,11] uyumlu olarak MSG’deki sodyumun ozmotik diüretik etkisi [20] desteklenmiştir. Hayvan modellerinde rutin izin durumunda MSG tüketim miktarını yansıtmak ve değerlendirmek için su alımı ve idrar çıkışının kullanılabileceği düşünülebilir. Ayrıca klinik açıdan, özellikle yüksek sıcaklıklarda, yüksek MSG’li bir diyet uygulayan kişilerde yeterli hidrasyon takviye edilmelidir.
İkinci gözlemimiz, 1H NMR metabolomik yaklaşımı, kısmen yüksek diyet tuzu alımıyla gözlemlenen benzer değişikliklerle desteklenen MSG sodyum içeriği [21]; MSG’nin renal atılımını azaltırken serum TMAO artışını indüklediğini ortaya çıkarmıştır (Şekil 2). TMAO, bağırsak mikrobiyotası tarafından TMA metabolizmasından üretildiğinden, 24 saat içinde böbrek tarafından atılır ve salgılanır [12], onun yolağı buradaki seviyelerle değerlendirilmiştir. Aynı zamanda böbrek tübüllerinde TMAO salgısını bloke ederek onun böbrek dokusunda birikmesine neden olan kıvrım diüretikleri ile gözlemlenen benzer değişikliklerin gösterdiği gibi [22] hücre hasarını önlemek için sodyum karşılığında hücre içi TMAO birikimine yol açan bir böbrek adaptif mekanizması da söz konusu olabilir. TMAO böbrek salgısı, organik anyonların ve katyonların yanı sıra zwitteriyonların kandan renal proksimal tübüler hücrelere bazolateral taşıyıcı aracılı alımı ile gerçekleşir ve daha sonra apikal taşıyıcı tarafından apikal membran yoluyla idrara verilir [23,24]. TMAO hücresel alımı için anahtar taşıyıcı, organik katyon taşıyıcı 2’dir (OCT2) [25], çoklu ilaç ve toksin ekstrüzyon proteini 1 (MATE1) ise TMAO’nun salgılanmasına katkıda bulunur [26]. İskemi/reperfüzyonun neden olduğu akut böbrek hasarına sahip sıçanlarda renal OCT2 ve MATE1’in düşük proteinleri ve mRNA ekspresyonu gözlenirken [27]; Oct 1/2 nakavt farelerde ise daha yüksek plazma seviyesi ve daha düşük TMAO renal alıkoyma bildirilmiştir [25]. Deneysel çalışmamızda akut böbrek hasarı belirteci olan NGAL araştırılmıştır. NGAL’ın değişiklikleri; azaltılmış TMAO atılımının, taşıyıcılar tarafından TMAO alımının veya dışarı akışının inhibisyonundan kaynaklanabileceği hipotezi ile uyumludur ve biz MSG’nin OCT2 ve MATE2 taşıyıcıları üzerindeki doğrudan etkisi hakkında yalnızca tahminde bulunabiliriz. Bununla birlikte, MSG’nin TMAO taşıyıcılarını değiştirdiği mekanizma için özel çalışmalar gerekli olacaktır. Benzer şekilde TMAO birikimi, kardiyak fonksiyon [14] ve böbrek [15,16] üzerinde olumsuz etkilere sahip olduğundan; biz kardiyovasküler ve böbrek hastalıklarında bir kofaktör olarak diyetle alınan MSG’nin etkisine ilişkin klinik çalışmaları teşvik ediyoruz.
Üçüncü gözlemimiz, idrar NGAL seviyelerinin çalışmamızda MSG kullanımını veya bırakılmasını takip etmesi olası bir akut böbrek hasarını desteklemiştir; aynı zamanda, değişmemiş kreatinin klirensi, H&E ve fibrozise rağmen yüksek serum kreatinin seviyeleri ve artan böbrek ağırlığı ile de bağdaşabilir (Şekil 3 ve 4). Bu durum, oksidatif strese [9] ikincil olarak uzun vadeli MSG tüketiminin [8] etkilerine ilişkin önceki gözlemlerimizle uyumluydu. Hem oral hem de parenteral MSG’nin; böbrek hasarına neden olduğuna dair başkaları tarafından yapılan tutarlı gözlemler [19,28], kronik böbrek hastalığı olan hastaların diyet önerileri için klinik tavsiyelere sahip olabilir.
Dördüncü gözlemimiz; TMAO bağırsak mikrobiyotası tarafından modüle edildiğinden, daha önce hayvan [11,19] ve insan [29] çalışmalarında bildirildiği gibi MSG’nin bu hayati alanı değiştirdiği doğrulanmış ve iki ana filum olan Firmicutes ve Verrucomicrobia’nın anlamlı değişiklikleri rapor edilmiştir (Şekil 5). Biraz şaşırtıcı bir şekilde, Firmicutes (Clostridrium, Desulfitobacterium, Enterococcus, Streptococcus, Haloanearobacter, Staphylococcus) ve Proteobacteria filumundaki TMAO veya TMA üreten bakterilerde anlamlı değişiklikler gözlemlenmemiştir [13]. Genetik, yaş ve kolonik lümenin pH’ı [30-32] dahil olmak üzere bağırsak mikrobiyotasını değiştirdiği bilinen faktörler, bu ve önceki çalışmamızdaki [11] farklı bulguların temelinde olabilir. Bununla birlikte her iki deneysel ortamda; MSG’nin, daha önce insan çalışmasında gözlemlenen Verrucomicrobia filumu gibi bağırsaktaki yararlı bakterilerin bolluğunu baskıladığını göstermiştir [29]. Çalışmamızda bulunan Verrucomycrobia filumunda önemli bir tür olan Akkermansia muciniphila’nın baskılanması (Şekil 6), daha önce TMAO seviyeleri ile de ilişkilendirilmişti [33] ve Akkermansia muciniphila bağırsak bariyeri, mukus kalınlığı ve bağırsak immün yanıtı ve nihayetinde faydalı klinik ilişkilerle [35,36] doğrudan bağlantılıdır [34]. Akkermansia muciniphila ile kıyaslandığında MSG’nin Lactobacillus intestinalis üzerindeki ters etkisi her iki bakteri de bağırsak bariyerinin korunmasında fonksiyonel rolleri sergilediğinden konakçıda homeostazı sürdürmek için telafi edici etkilere ikincil olabilir [34,37].
Sonuçlar
Sonuç olarak bu çalışmada sağlanan kanıtlar, MSG tüketiminin bağırsak mikrobiyotasını değiştirerek, bir nefrotoksin metaboliti olan TMAO’nun atılımını baskılayarak ve akut böbrek hasarının bir belirteci olan NGAL salınımını indükleyerek hayvan sağlığını etkilediği sonucunu desteklediğini bildirmektedir. MSG tüketimi yaygın olduğundan, onun insan sağlığı üzerindeki etkileri; en iyi şekilde TMAO yolağının iyi bir aday olabileceği klinik, histolojik ve biyokimyasal gözlemleri birleştirilerek daha fazla araştırılmasına ihtiyaç duyulmaktadır.
