Obezite ve İlişkili Metabolik Hastalıklar için Potansiyel Bir Biyoterapi Olarak Christensenella minuta’nın Yeni Bir Suşu

Özet: Obezite, yüksek Firmicutes/Bacteroidetes oranı ile karakterize edilen bağırsak mikrobiyota disbiyozu ile ilişkilidir. Christensenellaceae ailesinin bağırsakta yaşayan bakterilerinin, insan bağırsak ekosisteminin temel taşları olarak hareket ettiği ve adipogenezi önlediği öne sürülmüştür. Bu çalışmanın amaçları, Christensenella minuta’nın yeni bir suşunun antiobezite potansiyelini preklinik modellerde göstermek ve ilgili etki mekanizmalarını keşfetmektir. C. minuta DSM33407’nin antiobezite potansiyeli, diyete bağlı obezite fare modelinde incelenmiştir. Hepatik lipid metabolizmasındaki değişiklikler, hedeflenen transkriptomikler kullanılarak araştırılmıştır. Bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkiler, obez dışkı örnekleriyle inoküle edilmiş İnsan Bağırsak Mikrobiyal Ekosisteminin (SHIME®) insanlaştırılmış bir simülatöründe ayrıca değerlendirilmiştir. Her iki modelde de mikrobiyal topluluk yapılarını incelemek için shotgun metagenomikleri uygulanmıştır. C. minuta DSM33407, diyete bağlı obeziteden korumuştur ve glisemi ve leptin gibi ilişkili metabolik belirteçleri düzenlemiştir. Aynı zamanda, de novo lipogenezin güçlü bir inhibisyonu yoluyla hepatik lipid metabolizmasını düzenlemekte ve bağırsak epitel bütünlüğünü korumaktadır. İnsanlaştırılmış SHIME® modelinde bu etkiler, azalmış Firmicutes/Bacteroidetes oranı ile karakterize edilen bağırsak mikrobiyotasının düzenlenmesi ile ilişkilendirilmiştir. Bu veriler, C. minuta DSM33407’nin obezite ve ilişkili metabolik bozuklukların yönetimi için ikna edici bir terapötik aday olduğunu göstermektedir.

Anahtar Kelimeler: obezite, mikrobiyom, metabolik bozukluklar

1. Giriş

Christensenellaceae bakterilerinin bağırsak kommensal gram-negatif Clostridiales’e büyüyen bir ilgi bulumaktadır, çünkü son zamanlarda artan sayıda çalışma bunların zayıflık ve sağlıkla tutarlı ilişkisini bildirmiştir. Christensenella minuta, 2012 yılında bu ailede tanımlanan ilk türdür [1]. Goodrich ve arkadaşları 2014’te; C. minuta’yı insanlarda en kalıtsal bakteri taksonu olarak tanımlamışlardır [2] ve ayrıca, bir fare modelinde C. minuta ile viseral yağ kütlesi birikiminin azalması arasında nedensel bir bağlantı olduğunu göstererek, C. minuta’nın terapötik anti-obezite potansiyelini öne sürmüşlerdir.

İnsanlarda, Christensenellaceae birçok gözlemsel popülasyon çalışmasında defalarca zayıflıkla ilişkilendirilmiştir [3-6]. Ayrıca Christensenellaceae bakterilerinin kilo kaybı sırasında önemli ölçüde arttığı gösterilmiş ve bağırsak ekosisteminde bu bakterilerin varlığı ile enerji metabolizmasının düzenlenmesi arasında yakın bir ilişki olduğu düşünülmüştür [7]. Yaşlılarda, Christensenellaceae sağlıklı yaşlanma ile ilişkilendirilmiştir [8,9]. Crohn hastalığı [10,11], ülseratif kolit [12] ve irritabl bağırsak sendromu [13] dahil olmak üzere diğer hastalıklarda Christensenellaceae eksik mikroplar olarak tanımlanmıştır ve bu durum, Christensenellaceae’nın inflamasyonun düzenlenmesinde koruyucu bir rol oynayabileceğini göstermektedir. 

Gözlemsel çalışmalarda, Christensenellaceae’nin zayıflık ile ilişkilerinin ötesinde, dolaşımdaki LDL seviyeleri [5,14], hipertrigliseridemi [5,6], yüksek kan basıncı [15,16] ve hepatik fonksiyonun bir belirteci olan dolaşımdaki alanin transferaz (ALT) seviyeleri [6] gibi ilgili klinik belirteçlerle güçlü bir şekilde anti-ilişkili olduğu rapor edilmiştir. Bağırsak mikrobiyomunun disbiyozu; obezite ile ilişkili metabolik bozuklukların nedensel bir faktörü olarak öne sürüldüğü için [17], bu gözlemler Christensenellaceae ailesinin bakterileri tarafından enerji dengesi ve metabolik homeostazın düzenlenmesinde oynadığı önemli bir rolün göstergesi olabilir. Bu nedenle Christensenellaceae ailesinin bakterileri; obezite ve ilişkili metabolik bozuklukları tedavi etmek için canlı biyoterapötik ürünler olarak terapötik kullanım için büyük potansiyele sahiptir.  

Bu makalede, sağlıklı bir insan donöründen izole edilen yeni bir C. minuta örneğini tanımlıyoruz ve diyet kaynaklı obezite (DIO) fare modelindeki terapötik potansiyelini araştırıyoruz. Obeziteli donörlerden elde edilen mikrobiyota ile aşılanmış insan bağırsağının in vitro modelinde bu spesifik suşun kilit taşı işlevini değerlendiriyoruz.

2. Materyal ve Yöntemler

2.1. Bakteri Fenotipik Karakterizasyonu

2.1.1. Kültür Büyümesi

DSM 33407, önceden indirgenmiş Gifu anaerobik modifiye ortamında (GAMm, Hyserve, Uffing, Almanya) üç gün boyunca 37 °C’de anaerobik atmosferde (H₂ %5, CO₂ %5, N₂ %90) kültürlenmiştir.

2.1.2. Mikrobiyal Karakterizasyon

Tüm fenotipik testler üç kopya halinde gerçekleştirilmiş ve referans suşlar C. minuta DSM 22607 ve Bacteroides fragilis DSM 2151 kontrol olarak kullanılmıştır. DSM 33407’nin biyokimyasal karakterizasyonu, üreticinin talimatları izlenerek API 20A anaerobik test kiti (Biomérieux, Marcy l’Etoile, Fransa) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Şeritler 100 μL API 20 A ortamı ile aşılanmıştır ve ortam atmosferinde görsel değerlendirmeden önce anaerobik koşullarda 37 °C’de 48 saat inkübe edilmiştir. 

Oksidaz aktivitesi, bir damla DSM 33407 sıvı kültür eklendikten sonra şerit renk kayması ölçülerek oksidaz test şeritleri (VWR, Fontenay-sous-Bois, Fransa) ile belirlenmiştir. Katalaz aktivitesi, bir DSM 33407 kolonisine birkaç damla hidrojen peroksit %3 ve %12 solüsyonu eklenerek belirlenmiştir. Gram boyama ve spor oluşturma deneyleri daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirilmiştir [18].

Safra asidi ve pH toleransı, hem GAM modifiye broth hem de %1.5 agar kullanılarak değerlendirilmiştir. Sıvı broth sırasıyla %0, %2, %20, %40, %60 ve %80 safraya eş değer %0, %0.2, %2, %4, %6, %8 w/v Oxgall (BD Diagnostics, Le Pont de Claix, Fransa tarafından sağlanan Difco Laboratories) içermektedir.

Agar plakaları 4, 5, 6, 7 ve 8 pH seviyelerinde tamponlanmıştır. Broth ve agar ortamı önceden indirgenmiş ve 0.5 McFarland standardına (yaklaşık 10⁸ CFU/mL) eşdeğer bir bakteri süspansiyonu kullanılarak aşılanmıştır.

Agar plaka kutularına 3 μL inokulum bırakılmıştır ve anaerobik olarak 37°C’de beş gün süreyle inkübe edilmiştir. Büyüme görsel olarak; (+) büyüme, (-) büyüme yok veya (+/-) büyüme büyüme kontrolüne göre büyük ölçüde inhibe edilmiş, ancak büyümeden tamamen yoksun değil olarak değerlendirilmiştir. Sıvı kültür kaplarında, GAM ile modifiye edilmiş broth tüplerini aşılamak için 10 μL inokulum alikotu kullanılmış ve dört gün boyunca 37 °C’de anaerobik olarak inkübe edilmiştir. Büyüme, 600 nm’de optik yoğunluk ölçülerek değerlendirilmiştir (Biochrom WPA Biowave, Cambridge, UK).

Antibiyotik direnç testi, Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü’ne (CLSI) göre referans agar seyreltme yöntemi kullanılarak minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) kullanılarak gerçekleştirilmiştir [19,20]. Aşağıdaki antibiyotik stok çözeltileri hazırlanmış ve sterilize edilmiştir: Ampisilin (Merck, Darmstadt, Almanya), Seftriakson (USP, Frederick, MD, ABD), Kloramfenikol (Merck, Darmstadt, Almanya), Klindamisin (Merck, Darmstadt, Almanya), Meropenem ( USP, Frederick, MD, ABD), Metronidazol (Merck, Darmstadt, Almanya), Moksifloksasin (ChemPacific, Baltimore, MD, ABD), Piperasilin (Merck, Darmstadt, Almanya), Tazobaktam (USP, Frederick, MD, ABD), Tetrasiklindir (Merck, Darmstadt, Almanya). 5 μg/mL hemin (Merck, Darmstadt, Almanya), 1 μg/mL K₁ vitamini (Merck, Darmstadt, Almanya) ve %5 (v/v) hemolize uğramış koyun kanı (BD BBL, Le Pont de Claix, Fransa) ile takviye edilmiş Brucella agar  test ortamı olarak (Hemostat, Dixon, CA, ABD) kullanılmıştır. Farklı seyreltmelerde ilaç takviyeli agar plakaları hazırlanmış ve aşılamadan önce anaerobik ortam kabininde önceden indirgenmiştir. Bir DSM 33407 inokülümu, bir bulanıklık ölçer (Siemens Healthineers Dade Berhing MicroScan, Erlangen, Almanya) kullanılarak önceden indirgenmiş salin içinde 0.5 McFarland standardına eşdeğer olacak şekilde süspanse edilmiştir. Her bir bakteri hücre süspansiyonu daha sonra test plakalarını aşılamak için kullanılan paslanmaz çelik bir çoğaltıcı blok içindeki oyuklara aktarılmıştır. Çoğaltıcı üzerindeki uçlar, agar yüzeyine yaklaşık olarak 10⁵ CFU/noktaya karşılık gelen yaklaşık 1–2 μL inokulum bırakılmıştır. Plakalar, 37°C’de anaerobik koşullarda altı gün inkübe edilmiştir. MIC değerleri CLSI standartlarına göre belirlenmiş ve CLSI anaerob sınır değerlerine dayalı olarak duyarlı (S), orta (I) veya dirençli (R) olarak yorumlanmıştır [19,20]. 

2.1.3. 16S Genotipleme ve Filogenetik Analiz

Toplam DNA, üreticinin talimatlarına göre (Qiagen, Courtaboeuf, Fransa) MagAttract HMW DNA kiti kullanılarak 10⁹ bakteri hücresine eşdeğer bir C. minuta DSM33407 taneciğinden ekstre edilmiştir. DNA, bir Nanodrop spektrofotometresi (Thermo Fisher Scientific, Illkirch, Fransa) kullanılarak ölçülmüştür ve 1500 pb toplam parça uzunluğu sağlayan üniversal primerler (Ek Materyaldeki diziler) (melezleme sıcaklığı 55 °C) kullanılarak 16S rRNA PCR amplifikasyonu için 20 ng μL^-1 nihai konsantrasyona seyreltilmiştir. Çoğaltılmış ürünler Genewiz (Paris, Fransa) tarafından dizilmiştir. 16S dizisinin tamamı aşağıdaki erişim numarası kullanılarak GenBank’ta herkese açıktır: MW751847. 16S rRNA dizisi, refseq_RNA veri tabanına (NCBI) karşı püskürtülmüştür. MEGA-X 10.1.8 [21] kullanılarak bir maksimum olabilirlik ağacı oluşturulmuştur. Detaylar Ek Materyalde açıklanmıştır.

2.2. Hayvan Deneyleri

Tüm hayvan deneyleri, resmi etik yönergelerine (akreditasyon numarası C13-055-31; APAFIS#16306/APAFIS#17846/APAFIS#23402) uygun olarak akredite bir Sözleşmeli Araştırma Kuruluşunda (CRO, Biomeostasis, La Penne sur Huveaune, Fransa) gerçekleştirilmiştir. Toplam 120 adet beş haftalık C57Bl/6J erkek fare; aynı diyetle indüklenen obezite (DIO) fare modeli kullanılarak dört bağımsız çalışmada (çalışma başına 30 hayvan) kullanılmıştır. İki haftalık bir alışma periyodunun ardından tüm hayvanlar, vücut ağırlığına dayalı olarak her biri 10 kişilik üç uygulama grubuna rastgele dağıtılmıştır. Dört çalışmanın tümünde 20 hayvan, uygulamanın başladığı gün yüksek yağlı, sukrozdan zengin bir diyetle (HFD grubu, %45 cal yağ,  %20 cal sukroz, D12451i, Araştırma Diyeti) beslenmiştir. Diğer hayvanlar kontrol diyetiyle beslenmiştir (NC grubu, n = 10, A04, SAFE). HFD grubunun yarısı (n = 10) Christensenella minuta DSM33407’yi (sıvı formülasyon, PBS 1x, %1 gliserol, 2.10⁹ CFU/gün) alırken diğer yarısı sadece vehikül almıştır. NC grubu sadece vehikül almıştır. Tüm deneyler için, gıda alımı her üç günde bir ölçülmüş ve kalori alımı (kcal), diyetlerin enerji yoğunluğundan (kcal/g) hesaplanmıştır. Uygulama süresi, çalışmanın bitiş noktalarına bağlı olarak 4 ile 12 hafta arasında sürmüştür. Çerçeve, numune toplama ve analizler hakkında daha fazla ayrıntı Ek Materyalde bulunabilir.

2.3. Üçlü SHIME® Modeli

Çok düşük (<10⁶ kopya/g dışkı) Christensenella minuta miktarı gösteren obez dışkı örnekleri bu çalışma için kullanılmış ve Triple SHIME® deneyi standart koşullar [22] kullanılarak gerçekleştirilmiştir (daha fazla ayrıntı için eke bakın). Kısaca mide, ince bağırsak ve iki kolonik bölgeyi (proksimal ve distal kolon) simüle etmek için üç Triple SHIME® modeli paralel olarak çalıştırılmıştır. Sistem art arda üç hafta boyunca günlük olarak beslenmiştir. Uygulama periyodu, uygulama etkilerinin kalıcılığını değerlendirmeyi amaçlayan ürün arındırmasını bir hafta izlemiştir.  Haftalık bir örnekleme, DSM33407’nin varlığının değerlendirilmesine ve ekosistemdeki varyasyonların izlenmesine olanak sağlamıştır (bkz. Ek Materyal). 

2.4. Shotgun Metagenom Dizilimi

2.4.1. DNA Ekstraksiyon Prosedürü

Üreticinin talimatlarına göre DNeasy Power Soil Pro kullanılarak 0.2 mg numuneden DNA ekstrakte edilmiş ve Qubit 4 florometre ve Qubit™ dsDNA HS Assay Kit (Thermofisher Scientific, Illkirch, Fransa) kullanılarak ölçülmüştür. 

2.4.2. DNA Kütüphanesi Hazırlama

Nextera XT DNA Kütüphanesi Hazırlama Kiti (Illumina, Evry, Fransa ve Nextera Index Kit (Illumina, Evry, Fransa) kullanılarak, Ek Materyalde tanımlanan küçük değişikliklerle üreticinin protokolü izlenerek DNA kütüphanesi hazırlanmıştır. 

2.4.3. Illumina HiSeq4000 üzerinde dizilim

DNA kütüphaneleri, hedef okuma derinliğine dayanarak orantılı olarak bir araya toplanmıştır. Havuzlanan kitaplığın kalite kontrolü, havuzun parça boyutunu ve konsantrasyonunu incelemek için bir Tapestation (Agilent Technologies, Les Ulis, Fransa) ile yapılmıştır. Daha sonra havuzlanmış kitaplık seyreltilmiştir ve standart protokol kullanılarak denatüre edilmiştir. Son olarak, eşleştirilmiş uç dizilimi (2 x 150 bp) Illumina HiSeq4000 üzerinde gerçekleştirilmiştir. Örnekler ortalama 4.99 milyon okuma derinliği almıştır.

2.4.4. Mikrobiyota Analizi

Mikrobiyal NGS okumalarının taksonomik sınıflandırması, CosmosID Inc’den (Rockville, MD, ABD) tescilli yöntemler ve katalog kullanılarak yapılmıştır. Mikrobiyota analizi aile düzeyinde gerçekleştirilmiştir. Açıklamalı ve standartlaştırılmış veri kümesi, çok değişkenli analiz için R’ye (v.4.0.3) gönderilmiştir. Christensenella ile ilgili okumaların büyük bir bölümünün neden olduğu yanlılığı önlemek için Christensenellaceae değişkeni veri setinden çıkarılmıştır. Daha sonra tekrar standartlaştırılmış ve kümeler, ortalama merkezli ve birim varyans ölçekli veriler üzerinde temel bileşen analizi kullanılarak belirlenmiştir. Bray–Curtis mesafeleri üzerine bir PERMANOVA, “vegan” paketinden “adonis” fonksiyonu kullanılarak hesaplanmıştır (v. 2.5-7). İkili PERMANOVA karşılaştırmaları hesaplanmış ve Bonferroni düzeltmesi kullanılarak p değeri ayarlanmıştır.

2.5. İstatistiksel Analiz

Tek değişkenli istatistikler Prisms 8 (Graphpad, San Diego, CA, ABD) ile gerçekleştirilmiştir. Normallik dağılımı Shapiro–Wilk veya Kolmogorov–Smirnov testi kullanılarak değerlendirilmiştir. HFD’ye yanıt olarak vücut ağırlığı artışındaki bireyler arası değişkenlik göz önüne alındığında, standartlaştırılmış vücut ağırlığı artışı verileri üzerinde sistematik olarak bir uç değer tanımlaması (Grubb testi) yapılmıştır. Anormal vücut ağırlığı değişikliklerine sahip hayvanlar analizden çıkarılmıştır. Vücut ağırlığı değişiklikleri, gıda verimliliği ve glisemi değerlendirmesinden elde edilen veriler, iki yönlü ANOVA tekrarlanan ölçümleri ve ardından Dunnett’in çoklu karşılaştırmaları veya Fischer’in LSD testi ile analiz edilmiştir. Vücut kompozisyonu ve plazma belirteçlerinden elde edilen veriler, tek yönlü ANOVA ve ardından Holm-Sidak’ın çoklu karşılaştırmaları ile analiz edilmiştir. Histolojik puanlamadan elde edilen veriler, ikili Mann-Whitney testleri kullanılarak analiz edilmiştir. SHIME® verileriyle ilgili olarak, zaman noktalarına bağlı farklı örnek sayıları nedeniyle, tekrarlanan ölçümler ANOVA işlenememiştir. Bu nedenle, analizler Sınırlı Maksimum Olabilirliğin (REML) karışık bir modeline uygun yapılmıştır, ardından doğrulanmamış Fischer’in LSD testleri yapılmıştır. Tüm analizler için anlamlılık eşiği p = 0.05’e yerleştirilmiştir. Metin ve şekillerde veriler ortalama ±SEM olarak gösterilmiştir.

3. Sonuçlar

3.1. Suş İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Suş DSM33407, [23] tarafından tanımlandığı gibi bir kültürbilim yaklaşımı kullanılarak genç (<35 yaşında) sağlıklı bir insan donörün dışkı örneğinden izole edilmiştir. 16S rRNA kodlama bölgesi büyütülmüş (toplam parça uzunluğu 1116 pb) ve Christensenella minuta suşu DSM22607 (NR 112900.1) ile %99 benzerlik ile eşleştirilmiştir. Christensenella minuta ilk olarak; en yakın akrabalarının Caldicoprobacter oshimai, Tindallia californiensis ve Clostridium ganghwense olarak belirlendiği yerde Morotomi ve ark. (2012) tarafından tanımlanmıştır [1]. Böylece BLAST tarafından belirlenen en iyi 20 isabet ve dış grup olarak Listeria monocytogenes ile birlikte bu üç türün 16S rDNA’sı kullanılarak bir filogenetik ağaç inşa edilmiştir (Şekil 1B). Bu analiz, yeni izolatın Christensenella minuta DSM22607’ye çok yakın bir şekilde kümelendiğini doğrulamıştır.

Şekil 1. Christensenella minuta’nın bir türü olarak yeni DSM33407 suşunun sınıflandırılması. (A) TransmisScheme 33407. (B) 16S rRNA gen dizisine dayalı olarak DSM33407 suşunun en yakın akrabasını gösteren maksimum olabilirlik ağacı. Dış grup olarak Listeria monocytogenes suşu IC-45 kullanılmıştır. Dallardaki sayılar, 1000 tekrarlama kullanılarak doğrulanan yeniden örnekleme değerleridir. Kalın yazı DSM33407 16S rRNA dizisidir; koyu ve italik yazılar, 16S rRNA dizilerine dayalı olarak Morotomi ve diğerleri tarafından orijinal tip suş yayınında C. minuta DSM 22607 ile yakından ilişkili olarak tanımlanan 16S rRNA dizileridir [1]. 

Suş DSM33407; tam olarak anaerobik, hareketsiz, spor oluşturmayan, oksidaz ve katalaz aktiviteleri için negatif (Tablo 1) ve Gram-negatif boyanandır (Ek Şekil S1). Koloniler dairesel, kabarık, opak ve küçüktür (<1 mm). TEM mikroskobu kullanılarak gözlemlenen hücre morfolojisinde, Christensenella minuta DSM22607 [1] için tanımlandığı gibi, tek tek veya çiftler halinde meydana gelen konik uçlu kısa düz çubuklar olarak ortaya çıkmıştır (Şekil 1A). Ortalama boyutlar 1.77 ± 0.34 µm uzunluk ve 0.52 ± 0.03 µm genişlikteydi. Membran kalınlığı 35 ± 5 nm olup, Gram negatif türle uyumludur.

DSM33407; Christensenella minuta [1] tanımıyla tutarlı olan glukoz, salisin, ksiloz, ramnoz ve arabinozun (Tablo 1) asitleştirilmesi dışında çoğu enzim testi için negatiftir. DSM33407’nin çeşitli antibiyotiklere duyarlılığı, Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü’nün kılavuzuna (Tablo 2) göre değerlendirilmiştir [19,20]. DSM33407 suşu, tetrasiklin ve ampisiline dirençliydi. Safra asidi direnci, %80 safraya karşılık gelen 80 g/L Oxgall’a kadar gözlemlenmiştir (Tablo 1).

DSM33407 ve DSM 22607 suşlarının 16S rRNA dizilerinin %99’unu paylaştığı ve benzer mikrobiyolojik özellikler sergilediği gerçeğine dayanarak, DSM33407 suşunun Christensenellaceae ailesi, Clostridiales takımı, Clostridia sınıfı, Firmicutes filumu, Christensenella minuta türünün yeni bir suşu olduğu sonucuna vardık. 

3.2. DSM33407 Diyete Bağlı Obeziteden Korur ve İlişkili Metabolik Belirteçleri Düzenler

2014 yılında yayınlanan temel bir çalışmada; suş C. minuta DSM22607’nin vücut ağırlığı artışını ve yağlanmayı sınırladığı gösterilmiştir [2]. Böylece, bir diyetle indüklenen obezite (DIO) fare modelinde C. minuta DSM33407’nin antiobezite potansiyelini değerlendirdik, burada bakteriler vücut ağırlığı artışı ve metabolik parametreler üzerinde benzer sonuçlar veren dört bağımsız deneyde 4 ile 12 hafta boyunca ağızdan gavaj yoluyla günlük olarak (2.10⁹ CFU) uygulanmıştır. Fakat veriler bir araya toplanmamıştır ve Şekil 2’de yalnızca temsili sonuçlar gösterilmektedir. Diğer büyüme eğrileri için Ek Materyale bakınız (Ek Şekil S2). HFD’nin neden olduğu vücut ağırlığı artışı DSM33407 tarafından önlenmiştir ve normal diyet kontrolünden istatistiksel olarak ayrılamaz (Şekil 2A). Günlük gıda alımında hiçbir fark gözlemlenmemiştir (Ek Şekil S2). Yem etkinliği (FE) (Kcal’de g/toplam alınan kaloride BW kazancı) gıda metabolizasyon oranını yansıtacak şekilde hesaplanmıştır ve C. minuta DSM33407 uygulaması sırasında önemli ölçüde azaldığı gözlemlenmiştir (Şekil 2B). Bu; C. minuta DSM33407’nin beslenme alışkanlığını etkilemediğini, fakat gıda metabolizmasını etkilediğini göstermektedir. C. minuta DSM33407, vücut ağırlığı artışını ve ayrıca diyete bağlı hiperglisemiyi de önlemiştir (Şekil 2C). Makroskopik düzeyde, hayvanlar 40 gün boyunca C. minuta DSM33407 aldığında, mezenterik beyaz yağ dokusunun (WAT) yüksek yağlı diyet kaynaklı aşırı büyümesi önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 2D,E). 

Dolaşımdaki leptin seviyeleri, 12 haftalık C. minuta DSM33407 uygulamasından sonra önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 2F). Bu aynı zamanda 45 günde de gözlemlenmiştir (Ek Şekil S2C). Ayrıca kronik inflamasyon ile ilişkili bir başka adipokin olan plazma resistin seviyeleri, C. minuta DSM33407 uygulanan hayvanlarda önemli ölçüde azalmıştır ve bu, bakterilerin daha sağlıklı bir WAT aktivitesini desteklediğini göstermektedir (Şekil 2G). Son olarak, 12 haftalık uygulamadan sonra ölçülen vücut kompozisyonu, yağ kütlesi birikiminde önemli bir sınırlama olduğunu ortaya çıkarmıştır (Şekil 2H), oysa yağsız kütle önemli ölçüde etkilenmemiştir (Ek Şekil S4A). Dolayısıyla bu sonuçlar, C. minuta DSM33407’nin bir DIO fare modelinde obezite gelişimini önlediğini göstermektedir.

Şekil 2. C. minuta DSM33407, bir DIO fare modelinde (n = 10) viseral yağ kütlesi birikimini ve hiperglisemiyi önlemiştir. (A) Normal besin (NC) veya yüksek yağlı diyet (HFD) ile beslenen ve 4 hafta boyunca bir vehikül (Veh) veya C. minuta DSM33407 (DSM33407) solüsyonu ile oral gavaj uygulanan hayvanların büyüme eğrisi. (B) 4 haftalık uygulama periyodu süresince ilişkili yem etkinliği. C) Açlık glisemi başlangıçta ve 4 haftalık uygulama süresinin sonunda ölçülmüştür. (D) 40 günlük uygulamadan sonra mezenterik beyaz yağ dokusu hematoksilin ve eozin boyamasının temsili resimleri (ölçek çubuğu: 100 mm) ve ilişkili adiposit atrofisi skorları (E). Plazma leptin (F), resistin (G) ve yağ kütlesindeki (H) değişiklikler 12 haftalık uygulamadan sonra ölçülmüştür. Anahtar: BW, Vücut Ağırlığı; FE, Yem Etkinliği. İstatistikler: İki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA, ardından Benjamini, Krieger ve Yekutieli çoklu karşılaştırmalarının (A–C), Mann–Whitney U testi (E), tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey’nin çoklu karşılaştırmalarının iki aşamalı doğrusal adım adım prosedürü (F,G); * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.

3.3. DSM33407 Bağırsak Mikrobiyotasını ve Metabolik Aktivitelerini Düzenler

C. minuta DSM33407’nin antiobezite etkilerinin altında yatan etki mekanizmalarını aydınlatmak için, biz ilk olarak 40 günlük uygulamadan sonra taze dışkıda shotgun metagenomiklerini kullanarak önceden bahsedilen klinik öncesi çalışmalarda kullanılan DIO fare modelinde C. minuta DSM33407’nin bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkisini araştırdık. Aile düzeyinde analiz edilen standartlaştırılmış bakteri topluluğu bileşimi, HFD’nin Bacteroidaceae’yi büyük ölçüde azalttığını Streptococcaceae’ı ise arttırdığını ortaya koymuştur (Şekil 3A). C. minuta DSM33407 uygulanan grupta, Christensenellaceae dışkı mikrobiyotasının yaklaşık %20’sini temsil etmiştir (Şekil 3A). Sonuç olarak, Shannon indeksi tarafından yansıtılan bağırsak mikrobiyomunun çeşitliliği bu grupta önemli ölçüde azalmıştır (Ek Şekil S4). C. minuta DSM33407’nin varlığının neden olduğu bağırsak mikrobiyom ekosistemindeki tarafsız değişiklikleri tespit etmek için Christensenellaceae’yi veri setinden çıkardık, yeniden standartlaştırdık ve yeni matris üzerinde bir temel bileşen analizi (PCA) gerçekleştirdik. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, en büyük varyasyon kaynağı (%34.3) diyet tarafından yönlendirilmiştir (Şekil 3B). Bray-Curtis mesafelerini kullanan bir PERMANOVA analizi, üç grubun belirgin şekilde kümelendiğini göstermiştir (p = 0.047). Bonferroni’nin yöntemiyle ayarlanmış ikili bir PERMANOVA, yalnızca HFD-Veh ile NC-Veh gruplarının önemli ölçüde farklı olduğunu ortaya çıkarmıştır (p = 0.003). Bu nedenle, HFD-DSM33407 grubu, ne HFD-Veh’den ne de NCVeh grubundan istatistiksel olarak ayırt edilebilir, bu; iki kontrol grubu arasında bir ara durum olduğunu göstermektedir. Bu etki, HFD-DSM33407 grubunun dışkı mikrobiyom bileşiminin NC-Veh grubu ile birlikte konumlandığı dördüncü ana bileşende (PC4) (varyansın %7.2’si) yakalanmıştır. Özellikle bu iki grup, HFD-Veh grubuna kıyasla daha yüksek Prevotellaceae, Lactobacillaceae, Erysipelotrichaceae  ve Bifidobacteriaceae seviyeleri ile karakterize edilmiştir (Şekil 3B-D). Aksine, HFD-Veh grubuyla ilişkili ana bakteri aileleri; Deferribacteraceae ve Lachnospiraceae’dır (Şekil 3B–D).  Bu nedenle bu analiz, DSM33407 uygulamasının HFD’nin neden olduğu mikrobiyal kaymayı sınırladığını göstermektedir. 

Bu bulguları bağımsız ve insanla ilgili bir modelde doğrulamak için, taze insan dışkısı ile aşılanmış bir SHIME® modelinde C. minuta DSM33407 ile insan bağırsak mikrobiyomu arasındaki kronik etkileşimleri araştırdık [24]. Obeziteli üç donör, başlangıçta düşük Christensenella sp. (veri gösterilemiyor) seviyelerine göre seçilmiştir. Üç deney de paralel olarak yürütülmüş ve C. minuta DSM33407 (2.10⁹ CFU/gün) almıştır. Ana metabolitlerin üretimini izlemek ve shotgun metagenomik dizilimi kullanılarak mikrobiyom topluluğunun modülasyonlarını değerlendirmek için haftalık numuneler toplanmıştır. Mikrobiyota profillerinin analizi üzerine, bir donörün (donör A) büyük ölçüde Akkermansia muciniphila tarafından baskın olduğu ortaya çıkmıştır (Ek Şekil S6A–C). Herhangi bir önyargıdan kaçınmak için, bu donör analizin geri kalanı için çıkarılmıştır. Bu nedenle Şekil 4’te sunulan veriler, obeziteye sahip bağımsız donörlerle yapılan iki deneyin sonuçlarıdır. C. minuta yalnızca uygulama süresi boyunca tespit edilmiş, bu durum bakterilerin in vitro sistemin lümen bölmesine  yerleşemediğini göstermektedir (Ek Şekil S6D,E). C. minuta DSM33407 de çoğunlukla proksimal kolona karşılık gelen damarda tespit edilmiştir (Ek Şekil S6D,E).

Yine de, kısa zincirli yağ asitlerinde (SCFA’lar; asetat, bütirat ve propiyonat) her iki bölmede de önemli bir artış tespit edilmiş ve bu artış, temizleme süresi boyunca devam etmiştir (Şekil 4A–C). Buna paralel olarak, dallı zincirli amino asitlerin (BCAA’lar) metabolizmasından kaynaklanan ve bakteriyel proteoliz belirteçleri olarak işlev gören dallı zincirli yağ asitlerinin (BCFA’lar; izobütirik asit, izovalerik asit ve izokaproik asit) üretimi azalmış (Şekil 4D), amonyum seviyeleri ise değişmeden kalmıştır (Şekil 4E). Safra asidi değişiklikleri de izlenmiş ve hem proksimal hem de distal kolonik bölmelerde C. minuta DSM33407 uygulamasının akabinde ana safra asidi kolik asidin (CA/TCA) konjuge formlarına göre konjuge olmayan oranında bir artış gözlemlenmiştir (Şekil 4F,G). İlginç bir şekilde, ikincil safra asidi litokolik asit (LCA), temizleme süresi boyunca distal kolonda artmıştır (Ek Şekil S6F,G). Bu gözlemler, C. minuta DSM33407’nin birincil safra asitlerinin dekonjugasyonunu destekleyebileceğini göstermektedir; çünkü konjuge olmayan safra asitleri, LCA gibi ikincil safra asidi sentezi için substrattır. 

Şekil 3. C. minuta DSM33407, 40 günlük oral uygulamadan sonra değerlendirilen bir DIO fare modelinde fekal mikrobiyomu değiştirip düzenlemiştir (min n = 8). (A) Mikrobiyom profili, shotgun metagenomik profili kullanılarak değerlendirilmiş ve aile düzeyinde standartlaştırılmış yığılmış bir çubuk grafiğinde görüntülenmiştir. (B) Christensenellaceae familyasının çıkarılmasından sonra veri setinden hesaplanan PCA analiz puanları. Daha büyük nokta, %95 güven elipsi ile çevrili grup ortalama noktasını temsil etmektedir. (C) PCA yüklemeleri grafiği ve (D) ilişkili değişken katkılar. Renkli çubuk, maksimum katkı yüzdesine göre ölçeklenir.

Şekil 4. C. minuta DSM33407, insan obez kolonik mikrobiyotasıyla hazırlanmış bir İnsan Bağırsak Mikrobiyal Ekosistemi Simülatöründe (SHIME®) bağırsak mikrobiyota çeşitliliğini geliştirmiştir ve mikrobiyal metabolizmayı değiştirmiştir. Ana kısa zincirli yağ asitleri asetat (A), propiyonat (B) ve butirat (C) ile dallı zincirli yağ asitleri (BCFA’lar) (D) ve amonyum (E) konsantrasyonları üç zaman noktasında, yani başlangıç (Temel), üç haftalık uygulamadan sonra (DSM33407) ve temizleme döneminde (Yıkama) proksimal ve distal kolonda (sırasıyla PC ve DC) ölçülmüştür. Benzer şekilde, birincil safra asidi kolik asidinin konjuge formları üzerinde konjuge olmayan formlarının oranı, proksimal (F) ve distal (G) kolonda (n = 2) ölçülmüştür. Shotgun metagenomik verileri, başlangıçta, uygulamanın üç haftasında (sırasıyla tedavinin birinci, ikinci ve üçüncü haftalarına karşılık gelen TR1, TR2 ve TR3) ve Shannon İndeksini (H) ve filum seviyesindeki (I) nispi bolluğu kullanarak bağırsak mikrobiyota çeşitliliğini değerlendirmek için temizleme (WO) sırasında haftalık olarak toplanmıştır. Anahtar: CA, Kolik Asit; TCA, Taurokolik Asit. İstatistikler: doğrulanmamış Fischer’ın LSD (A–E) tarafından takip edilen karışık REML; H: Her bölme için bağımsız olarak yapılan istatistikler. Kontrol grubu olarak temel çizgi ile Dunnett testinin tarafından takip edilen tek yönlü ANOVA. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p< 0,0001.

Bu metabolik değişikliklerle birlikte, biz temizleme süresi boyunca sürdürülen C. minuta DSM33407 uygulamasının ilk haftasında olduğu gibi başlangıçta distal kolondaki mikrobiyal topluluk çeşitliliğinin Shannon indeksinde önemli bir artış gözlemledik (Şekil 4H). Çeşitlilikteki bu artışa, Firmicutes seviyeleri düşerken Bacteroidetes seviyelerinde belirgin bir artış eşlik etmiştir (Şekil 4I). Bu nedenle, hem hayvan hem de in vitro insan bağırsak modelleri, C. minuta DSM33407 uygulamasının bağırsak bakteri topluluğu üzerinde derin bir etkisi olduğunu göstermiştir. 

3.4. DSM33407 Hepatik Lipid Metabolizmasını Düzenleme ile İlişkilendirilir

HFD’ye maruz kalma sırasında C. minuta DSM33407 uygulaması ile ilişkili metabolik adaptasyonlar hakkında bazı görüşler elde etmek için önce bakterilerin bağırsak lipid emilimini önleyip önlemediğini sorguladık. Fekal trigliseritler ve serbest yağ asitleri (FFA), 53 günlük uygulamadan sonra ölçülmüş ve HFD-Veh ve HFD-DSM33407 grupları arasında hiçbir fark ortaya çıkmamıştır (Şekil 5A,B). Daha sonra aynı belirteçleri karaciğer biyopsilerinde değerlendirdik ve hem hepatik trigliseritlerde hem de FFA’da önemli bir düşüş gözlemledik (Şekil 5C,D). Bu, ana metabolik yollarda yer alan seçilmiş bir hepatik gen panelinin ekspresyon seviyelerini değerlendirerek daha fazla araştırdığımız HFD-DSM33407 grubunda, hepatik lipid metabolizmasının bazı spesifik düzenlemelerini göstermiştir (Ek Tablo S1). Şekil 5E,F’de gösterildiği gibi, glukokinaz için Gck geni kodlama önemli ölçüde bastırılmıştır. Glikoz taşıyıcı GLUT4’ü kodlayan Slc2a4, ve yağ asidi sentazını kodlayan Fasn gibi diğer genler düzenlenme eğilimindeydi, ancak bu değişiklikler istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (Şekil 5G,H). Bu gözlem, hayvanlara aynı oral günlük C. minuta DSM33407 doz ile 40 gün uygulanan bir çalışmada bağımsız olarak tekrarlanmıştır (Ek Şekil S2). GCK, lipogenezin düzenlenmesi ile de bağlantılı olan hepatik glikolizin düzenlenmesinde rol oynayan anahtar bir enzimdir [25]. Burada, Gck baskısı boyunca hepatik FFA’daki güçlü düşüş, C. minuta DSM33407’nin hepatik lipid sentezinin düzenlenmesinde rol oynayabileceğini göstermektedir.

Şekil 5. C. minuta DSM33407, diyete bağlı obezite fare modelinde lipid metabolizmasını değiştirip düzenler. 40 günlük uygulamadan sonra dışkı trigliserit (A) ve serbest yağ asidi (B) seviyeleri (n = 10). 40 günlük uygulamadan sonra hepatik trigliserit (C) ve serbest yağ asidi (D) seviyeleri (n = 10). (E) 50 günlük uygulamadan sonra NC-Veh kontrolüne göre hepatik gen ekspresyon analizi (n = 5). Gck (F), Slc2a4 (G) ve Fasn (H)’ın kat değişim değerleri. Anahtar: TG, Trigliseritler; FFA, Serbest yağ asitleri. İstatistikler: (A-C) Mann–Whitney U testi, (D) eşleştirilmemiş t-testi; (F, G ve H) Benjamini, Kriger ve Yekutieli’nin iki aşamalı doğrusal adım adım prosedürü tarafından takip edilen tek yönlü ANOVA * p < 0.05, **** p < 0.0001.

3.5. DSM33407 Bağırsak Epitel Bütünlüğünü Korur

Son olarak, birkaç çalışma DIO fare modelinin artmış geçirgenliğe sahip değiştirilmiş bir bağırsak epitel membranı sergilediğini gösterdiğinden [26,27], C. minuta DSM33407’nin bağırsak bariyerinin restorasyonu yoluyla obezite ile ilişkili metabolik belirteçlerin iyileştirilmesine katkıda bulunabileceğini varsaydık. İlk olarak RT-QPCR ile 40 gün HFD’ye maruz kaldıktan sonra DIO farelerinin kolonundaki ana sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonunu analiz ettik ve uygulama yapılmamış hayvanlara kıyasla HFD-DSM33407 grubunda Ocln ve Zo1 ekspresyonunda önemli bir artış gözlemledik ( Şekil 6A,D). Ayrıca DSM33407uygulamasının ardından Cldn1 ifadesi için artan bir eğilim tespit etmemize rağmen (Şekil 6B), Cldn2 ifadesi değişmeden kalmıştır (Şekil 6C). Daha sonra bunu, transepitelyal elektrik direncine (TEER) dayalı geleneksel bir bariyer bütünlüğü modeli kullanarak in vitro olarak daha fazla araştırdık ve C. minuta DSM33407’nin güçlü bir koruyucu etkisini gözlemledik (Şekil 6E). Böylece, C. minuta DSM33407’nin yüksek yağ yüklemesi sırasında bir membran bariyer koruyucusu olarak hareket etme potansiyeline sahip olduğu sonucuna vardık.

Şekil 6. C. minuta DSM33407, hem in vivo hem de in vitro preklinik modellerde bağırsak bariyeri bütünlüğünü korumaktadır. 40 günlük uygulamadan sonra bir DIO fare modelinde kolonik sıkı bağlantı proteinleri Occludin (Ocln) (A), Claudin 1 (Cldn1) (B), Claudin 2 (Cldn2) (C) ve Zonula occludens-1 (Zo1) (D)’nin kat değişimi ifadesi (n = 6). (E) Proinflamatuar sitokin TNF-a’ya maruz kalma üzerine in vitro Trans-Epitel Elektriksel Direnç (TEER). İstatistikler: Tukey’nin (A–D) veya Dunett’in (E) çoklu karşılaştırmaları tarafından takip edilen tek yönlü ANOVA; tümü için: * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.

4. Tartışma

Bu çalışmada, sağlıklı bir insan donörden izole edilen insan ortak türü C. minuta’nın yeni bir suşunu tanımladık. Standart bir API test sistemi kullanılarak; yeni C. minuta DSM33407 suşu, tip suşu tarafından zayıf bir şekilde üretildiği bildirilen ve bizim gözlemleyemediğimiz mannoz haricinde, orijinal tip C. minuta DSM22607 için tanımlananlara benzer enzim aktiviteleri göstermiştir. C. minuta, sağlıklı bireylerin insan bağırsağında doğal olarak bulunan alt baskın Clostridiales türleridir [28]. Bağırsak mikrobiyomunun yaklaşık %0.2-2’si arasında değişen düşük bollukları nedeniyle, epidemiyolojik çalışmalarda gözden kaçma eğilimindedirler ancak yeni bir makale bir Çin topluluğunda onların yaygınlıklarının %50 civarında olduğunu ortaya koymuştur [6]. Bununla birlikte, C. minuta ve sağlık arasındaki ilişki büyük ölçüde belgelenmiştir [28]. İnsan çalışmalarında en belirgin ilişkilerden biri, obezite ve dolaşımdaki kolesterol gibi ilgili metabolik belirteçler ile ters orantılı olmasıdır [5,14]. Ayrıca önceki bir çalışma, bağırsak mikrobiyotasında C. minuta varlığı ile hayvan modellerinde düşük adipozite arasında nedensel bir bağlantı olduğunu göstermiştir [2]. Bu nedenle, bu yeni C. minuta suşunun antiobezite potansiyelini araştırdık ve bir DIO fare modelinde güçlü antiobezite aktivitesini doğruladık. Ne gıda alımı ne de fekal yağ kaybı üzerinde herhangi bir etki tespit edemediğimizden; ancak gıda verimliliğinde önemli bir azalma tespit ettiğimizden, C. minuta DSM33407’nin enerji tüketimini metabolik olarak düzenlediğini varsaydık. Tutarlı bir şekilde, C. minuta DSM33407’nin, HFD ile beslenen hayvanlarda hepatik lipid birikimini azalttığını gözlemledik; bu, hepatik glukokinazı kodlayan Gck geninin güçlü bir şekilde bastırılmasıyla bağlantılıydı. GCK’nın vücut ağırlığının düzenlenmesindeki rolü daha önce bildirilmiştir ve aşırı ekspresyonu, kahverengi yağ dokusundaki (BAT) termojenik proteinlerin aşağı regülasyonu yoluyla vücut ağırlığı kazanımını kolaylaştırır [29]. Aslında, ayrıştırıcı protein UCP1’in uyarlanabilir adrenerjik titremesiz termogenezi indüklediği uzun zamandır bilinmektedir [30] ve sempatik sinir aktivitesi yoluyla hepatik GCK tarafından regüle edilmektedir [31]. Mantıksal olarak, Gck’nın aşağı regülasyonunun Ucp1 ekspresyonunun yukarı regülasyonuyla ve artan termogenezle ilişkili olabileceği hipotezini test ettik, ancak BAT’ta Ucp1 ekspresyonunda herhangi bir farklılık tespit edemedik (veriler gösterilmemiştir). Titremesiz termogenezin diğer önemli aktörleri henüz C. minuta eylemi ile ilgili olarak değerlendirilmediğinden, Gck aracılı termoregülasyonun C. minuta DSM33407 uygulaması ile ilgili potansiyel katılımı hakkında kesin sonuçlar çıkarmak için daha fazla analiz yapılması gerektiğine inanıyoruz. Ayrıca, bu deneylerde yalnızca Gck’in önemli ölçüde bastırılmış olması, bu modelde C. minuta DSM33407’ye karşı hepatik yanıtın erken bir belirteci olabileceğini gösterir. Bu bakterilerin enerji metabolizması üzerindeki etkisini tam olarak anlamak için daha uzun bir uygulama periyodundan sonra hepatik gen ekspresyonunun kapsamlı bir analizi gerekli olacaktır.

Azalmış vücut ağırlığı artışı ile tutarlı olarak, C. minuta DSM33407’nin uygulanması, daha düşük yağ kütlesi ve mezenterik WAT’ın azalmış hipertrofisi ile ilişkilendirildi. Yağ kütlesi üzerindeki bu etki, adipokinler leptin ve resistin’in dolaşımdaki daha düşük seviyeleri aracılığıyla hormonal düzeyde de yansıtıldı. Resistin, esas olarak farelerde yağ dokusu tarafından eksprese edilen ve salgılanan ve obezitenin neden olduğu insülin direncinde bir aracı olarak önemli bir rol oynayan bir polipeptit hormonudur [32]. Daha önce bildirildiği gibi [32], C. minuta DSM33407 uygulaması tarafından önemli ölçüde engellenen DIO farelerinde dolaşımdaki resistin seviyelerinde güçlü bir artış gözlemledik. Resistinin de glisemiyi düzenlediği gösterildiğinden, DIO modelinde C. minuta DSM33407 ile ilişkili açlık glisemisinin normalleşmesine, resistin üzerindeki etkinin kısmen aracılık etmesi olasıdır.

Bağırsak düzeyinde, C. minuta DSM33407, HFD’nin neden olduğu mikrobiyal kaymayı en aza indirdi. Bu gözlem, DSM33407’nin kronik günlük uygulamasının distal kolonda mikrobiyal çeşitliliği önemli ölçüde iyileştirdiğini ve obez fekal mikrobiyota ile aşılanmış insanlaştırılmış bir SHIME® modelinde Firmicutes/Bacteroidetes oranını restore ettiğini gözlemlediğimiz çalışma in vitro olarak tamamlandı (Şekil 4). Firmicutes/Bacteroidetes oranının değişmesi, obezitede bağırsak mikrobiyota disbiyozunun bir özelliğidir [33]. Bu oranın eski haline getirilmesi, obezite ile ilişkili disbiyozun tek bir bakteri türü kullanılarak düzeltilebileceğine dair umut verici bir işarettir. Bununla birlikte, disbiyotik mikrobiyomun metabolik işlevlerini geri yüklemek, mikrobiyom temelli tedavilerin hedeflediği nihai son nokta olmalıdır. Bu nedenle, SHIME® modelinde bağırsak mikrobiyomunun başlıca metabolik enson noktalarını ölçtük. C. minuta ile indüklenen mikrobiyal kayma, hem proksimal hem de distal kolonda artan SCFA’lar ve daha düşük BCFA seviyeleri ile ilişkilendirildi; bu, DSM33407’nin karbonhidrat fermantasyonunu uyardığını ve proteolizi azalttığını gösterir. Kolonik SCFA’lar, sağlıklı bir bağırsak zarının korunmasına katkıda bulunan bağırsak epitelyal bariyer seviyesindeki trofik fonksiyonların düzenlenmesi gibi yararlı etkileri için büyük ölçüde belgelenmiştir [34]. İlginç derecede, C. minuta DSM33407’nın SCFA üretimini değerlendirdik ve suşun tip suşu [1] için açıklandığı gibi yüksek bir asetik asit üreticisi ve orta derecede bütirik asit üreticisi (Ek Şekil S7) olduğunu doğruladık. Artan SCFA seviyelerinin, C. minuta DSM33407’ye maruz kalmanın ardından mikrobiyal ekosistemin metabolik aktivitesinin bir modülasyonu tarafından yönlendirildiğini doğrulayan herhangi bir propiyonat üretimi tespit etmedik. İlgi çekici bir şekilde, SCFA’ların sistemik enerji harcamasını düzenlediği bilinmektedir [35] ve en azından, onların hepatik lipid metabolizması üzerinde gözlemlediğimiz güçlü etkiyi iletmeleri mümkündür.

Son olarak, C. minuta DSM33407’nin in vitro ve in vivo olarak intestinal sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonunu geliştirdiğini gözlemledik. Obezitede sıkı bağlantı proteinlerinin gevşemesine bağlı olarak artan bağırsak geçirgenliği, obezite ile ilişkili kronik düşük dereceli inflamasyonun itici faktörlerinden biri olarak öne sürülmüştür [36,37]. SCFA’ların ve özellikle bütirik asidin bağırsak membran bütünlüğünü geri kazandırdığı gösterilmiş olsa bile [38], SCFA üretiminin C. minuta DSM33407 kaynaklı sıkılaşma etkisinde bir rol oynayıp oynamadığını değerlendirmek için daha fazla analiz yapılmalıdır. Yine de bu, C. minuta DSM33407’nin bağırsak sağlığını iyileştirmedeki faydalı etkisine işaret eden bir başka cesaret verici gözlemdir.

5. Sonuçlar

Bu çalışma, C. minuta DSM33407’nin bir DIO fare modelinde vücut ağırlığı artışını sınırlandırdığını ve obezitenin bir sonucu olarak yukarı regüle edilen birkaç metabolik belirteci normalleştirdiğini göstermektedir. Ayrıca C. minuta DSM33407’nin etki biçimini inceledik ve obezitesi olan bireylerde bağırsak mikrobiyota çeşitliliğini geri kazanmak, bağırsak epitel bütünlüğünü korumak ve yağlanmayı sınırlamak için benzersiz işlevler taşıyan alt baskın bir tür olan kilit taşı bakteri olarak hareket ettiğini öne sürdük. Ayrıca C. minuta DSM33407’nin etki biçimini ele aldık ve obezitesi olan bireylerde bağırsak mikrobiyota çeşitliliğini geri kazanmak, bağırsak epitel bütünlüğünü korumak ve yağlanmayı sınırlamak için benzersiz işlevler taşıyan alt baskın bir tür olan kilit taşı bakteri olarak hareket ettiğini gösterdik. Toplamda, bu bulgular C. minuta DSM33407’nin terapötik potansiyelini güçlü bir şekilde destekler ve daha fazla klinik değerlendirmeyi garanti eder. Böylece, şu anda FDA düzenlemesi kapsamında bir Faz 1 klinik denemesinde C. minuta DSM33407’nin güvenliğini ve tolere edilebilirliğini değerlendiriyoruz.