2′-Fukosillaktoz Üzerine Son Gelişmeler: Fizyolojik Özellikler, Uygulamalar ve Üretim Yaklaşımları

ÖZET

Trisakkarit, 2′-fukosillaktoz (Fucα1-2Galβ1-4Glc; 2′-FL), insan sütünde en bol bulunan oligosakkarittir. Prebiyotikler, antibakteriyel, antiviral ve immünomodülatör etkiler dahil olmak üzere çok sayıda önemli biyolojik özelliklere sahiptir. Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından “genellikle güvenli olarak  kabul edilmiş” (GRAS) ve Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi (EFSA) tarafından yeni bir gıda (NF) olarak onaylanmıştır. 2′-FL, sadece bebek formülüne eklenen bir gıda bileşeni olarak değil aynı zamanda gıda biyoproseslerinde bir diyet takviyesi ve tıbbi gıda malzemesi olarak da hizmet etmektedir. Yeri doldurulamaz beslenme uygulamaları nedeniyle 2′-FL’ye önemli bir ticari ilgi bulunmaktadır. Bu derleme, 2′-FL’nin temel işlevsel özelliklerini ve uygulamalarını sistematik olarak detaylı bir şekilde açıklamayı amaçlamaktadır. Ayrıca bu derlemede kimyasal, kemo-enzimatik ve hücre fabrikası yaklaşımları dahil olmak üzere 2′-FL üretimi için çeşitli yaklaşımlar açıklanmış ve önemli araştırma sonuçları da özetlenmiştir. Metabolik mühendislik ve sentetik biyoloji stratejilerinin hızlı gelişimi ile 2′-FL büyük ölçekli üretimi için tasarlanmış hücre fabrikasını kullanmak umut verici bir yaklaşım olabilir. Ekonomik ve güvenlik açısından, 2′-FL biyoproseste hücre fabrikası mühendisliği için mikrobiyal seçim de dikkate alınmalıdır.

Giriş

Anne sütü genellikle yenidoğanlar için en önemli besin kaynağı olarak kabul edilmektedir. Bebek maması sütünde bulunan yaygın beslemenin ötesinde benzersiz faydalar sağlayan özel bir bileşime sahiptir. Son birkaç on yılda, farklı bakış açılarına ve ilgi alanlarına sahip çocuk doktorları, mikrobiyologlar, kimyagerler ve diğer bilim insanları tarafından anne sütüyle ilgili kapsamlı çalışmalar yürütülmüştür. Artan kanıtlar, insan sütü oligosakkaritlerinin (HMO’lar) anne sütünün mükemmel etkilerinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir (Bode 2012).  Başlangıçta HMO’lar, anne sütüyle beslenen yenidoğanlar için sağlık yararları ile birlikte istenen bakterilerin büyümesini destekleyen ve bağırsak mikrobiyota bileşimini modüle eden bir prebiyotik olarak keşfedilmiştir. Daha sonra in vitro ve in vivo deneylerden elde edilen kapsamlı veriler, HMO’ların konakçının epitelyal hücre yüzeyi glikomunu değiştirerek mikrobiyal enfeksiyonları doğrudan azalttığını ve bağışıklık tepkilerini modüle ederek bebeğin bağışıklık sistemini dolaylı olarak etkilediğini doğrulamıştır. Ayrıca HMO’ların özellikle yenidoğanların yaşamlarının ilk aylarında beyin gelişimi için temel bir besin maddesi olduğu kanıtlanmıştır (Bode 2009, 2012, 2015; Walker ve Iyengar 2015; Yu vd. 2013). 

Şekil 1’de gösterilen HMO’lar (5-15 g/L), olgun insan sütünün laktoz (70 g/L) ve lipidlerden (40 g/L) sonra en bol bulunan üçüncü bileşendir (Bode 2009; Zivkovic vd. 2011). HMO’lar çok çeşitli oligosakkarit yapıları ve 200’den fazla farklı izomerden oluşmaktadır ve 100’den fazla HMO yapısı iyi belgelenmiştir (German vd. 2008; Kobata 2010; Wu vd. 2011; Wu vd. 2010). Bunların arasında, HMO’ların yaklaşık yarısından fazlası fukosile edilmiştir (Smilowitz vd. 2014). Başlıca 2′-fukosillaktoz (2′-FL), 3-fukosillaktoz (3-FL), lakto-N-fukopentaoz (LNFP), lakto-N-difukoheksaoz (LNDFH) dahil olmak üzere fukosile HMO’ların anne sütü ile beslenen yenidoğanlar için birçok önemli biyolojik aktiviteye sahip olduğu bildirilmiştir (Chen 2015). α-(1,2)-bağlantısı yoluyla laktoz ve fukoz ile oluşan bir tür trisakkarit olan 2′-FL, toplam HMO’ların %30’undan fazlası ile en bol bulunan fukosile oligosakkarittir. Bugüne kadar, yeri doldurulamaz fizyolojik etkileri olan 2′-FL, HMO’larda en umut verici oligosakkaritlerden biridir ve yalnızca büyük ölçekli üretimde değil, aynı zamanda ticari uygulamalarda da büyük ilgi görmüştür. 

Önemli fizyolojik işlevleri nedeniyle, 2′-FL’nin bebek maması sütüne katılmasına büyük ilgi vardır. Son yıllarda, 2′-FL içeren ürünler, dünya çapında çeşitli üreticiler tarafından üretilen farklı bebek maması sütlerinde ortaya çıkmıştır. Ancak yüksek maliyet, ticarileştirilmiş 2′-FL’nin bulunmasını sınırlamıştır (Bych vd. 2019). Buna karşılık ekonomik sebep 2′-FL’nin biyosentezinin gelişimini teşvik etmiştir. Kimyasal, kemo-enzimatik ve hücre fabrikası yöntemleri dahil olmak üzere büyük ölçekli 2′-FL üretimi için çeşitli yaklaşımlar oluşturulmuş olsa da düşük verim ile birlikte karmaşık çoklu koruma ve koruyucu grubun uzaklaştırılması prosedürleri nedeniyle kimyasal sentezin 2′-FL üretim taleplerini karşılamaya uygun olmadığı açıktır (Roussel vd. 2001; Schmidt ve Thiem 2010). Bu nedenle, biyolojik sentez yöntemleri, 2′-FL’nin büyük ölçekli üretimi için daha avantajlıdır. Bu derleme başlıca 2′-FL üretimi için kimyasal ve ileri biyoteknolojik sentez yöntemleri üzerine son araştırmaları sunmaktadır. Ayrıca bildiğimiz kadarıyla bu makale 2′-FL’nin fizyolojik özelliklerinin ilk sistematik incelemesidir ve 2’FL’nin bebek maması sütü alanındaki uygulamaları da anlatılmıştır.

Şekil 1. Anne sütünün genel bileşimi ve oranı (Thurl vd. 2017’e göre)

HMO’lara kısa bir giriş

Yapı

HMO’lar çeşitli ve kompleks şekerleri içerirler. Son yıllarda, HMO’ların yapısal çalışmaları analizciler ve kimyagerler tarafından yapılmıştır. İnsan sütündeki oligosakkaritlerin bileşimini ve yapısını belirlemek için; kapiler elektroforez, kütle spektrometrisi (MS), yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), yüksek performanslı anyon değiştirme kromatografisi (HPAEC) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) dahil olmak üzere birçok analitik yöntem kullanılmıştır (Amano vd. 2009; Coppa vd. 1999; Kobata 2010; Pfenninger vd. 2008). Özellikle, sınırlayıcı HPLC-Chip/MS analitik cihazları, bir dizi oligosakkaritin profilini çıkarmak için yeni bir strateji sağlamaktadır (Ninonuevo vd. 2006, 2007). D-glukoz (Glc), D-galaktoz (Gal), N-asetilglukozamin (GlcNAc), L-fukoz (Fuc) ve N-asetilnöraminik asit (Neu5Ac) dahil olmak üzere beş monosakkaritin HMO’ların temelini oluşturduğu doğrulanmış, farklı polimerlerle ayrılmış 200’den fazla HMO bulunmuştur (Han vd. 2012). Başlıca kompleks şekerlerin uzama ve dallanmasından sorumlu olan en az 13 çekirdek oligosakkarit tanımlanmıştır. Bu çekirdek oligosakkaritlere fukosile ve sialile edilmiş kalıntılar eklenerek 100’den fazla oligosakarit oluşturulur (Kobata 2010; Wu vd. 2010, 2011). En bol bulunan oligosakkaritler %70’in üzerinde bir oranla fukosile olanlardır ve geri kalanlar sialile edilmiş oligosakkaritlerdir (Ninonuevo vd. 2006). 

Fizyolojik Özellikler

Anne sütünün bebeğin büyüme taleplerini karşılaması için gerekli tüm besin maddelerini içerdiği iyi bilinmektedir ve bu fonksiyonel besin bileşenlerinin çoğunun HMO’lar olduğuna dair çok sayıda kanıt bulunmaktadır (Bode 2009). HMO’lar, tercihen Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum ve Bifidobacterium infantis gibi faydalı mikroorganizmalar tarafından tüketilen prebiyotikler olarak rol oynayan anne sütünde 3-20 polimerizasyon derecesine sahip oligosakkaritlerdir. Bifidobakteriler, bağırsakta patojenlerin gelişmesini engelleyen özel metabolitler (laktik asit ve kısa zincirli yağ asitleri) üretirler. Bifidobakteriler ayrıca yüzey bağlanma yerlerini işgal eder ve zararlı bakterilerin yapışmasını engellerler. Bağırsağın yüzeyine bağlanmış anne sütü glikanı, patojenik mikroorganizmalar için çözünür tuzak reseptörleri olarak hizmet etmekte ve böylece enfeksiyon riskini azaltmaktadır (Chichlowski vd. 2012; Gibson ve Wang 1994; Locascio vd. 2007; Newburg vd. 2005; Zivkovic vd. 2011). HMO’ların, anne sütüyle beslenen bebeklerde diyare insidansını düşürmede önemli etkileri olduğu düşünülmektedir (Morrow vd. 2004). Ayrıca yenidoğan için bağışıklık sistemini modüle etmek ve beyin gelişimini desteklemek gibi diğer etkilerle ilgili çeşitli çalışmalar bildirilmiştir (Smilowitz vd. 2014; Wang 2012; Yatsunenko vd. 2012).

Mevcut kaynaklar

HMO’lar emzirme döneminde başlıca anne sütünde bulunur ve evcil hayvanların olgun sütünde çok nadirdir (Bode 2012). Oligosakkarit miktarı anneler arasında çok farklıdır ve emzirme dönemi boyunca 5-25 g/L arasında değişmektedir (Chaturved vd. 2001; Gabrielli vd. 2011). Keçi sütünün oligosakkarit içeriği 0.25-0.30 g/L’dir; bu değer sığır ve koyun sütünden sırasıyla 0.03-0.06 ve 0.02-0.04 g/L daha yüksektir, ancak yine de insan sütündeki konsantrasyonun çok altındadır (Lane vd. 2010). Anne sütünde birçok oligosakkarit yapısı benzersizdir ve fukosile oligosakkaritler insan sütünün en önemli bileşenlerinden biridir. Sığır sütü bu bileşenlere sahip değildir ve keçi sütü tanımlandığı düzeydeki gibi çok düşük bir içeriğe sahiptir (Oliveira vd. 2015). Anne sütündeki bu benzersiz fukosile oligosakkaritler, anne sütüyle beslenen yenidoğana özel faydalar sağlamada çok önemli bir rol oynamaktadır. Fukosile oligosakkaritler arasında 2′-FL, bu benzersiz fizyolojik etkilere sahip olduğu en iyi belgelenmiş oligosakkarittir.

Şekil 2. Prebiyotikler (A), yapışma önleyici antimikrobiyaller (B), immünomodülatörler (C) ve beyin için besin sağlayıcılar (D) dahil olmak üzere 2′-FL’nin temel fizyolojik özellikleri.

2′-FL’nin Fizyolojik İşlevleri

Prebiyotik Etkisi

Prebiyotik ilk olarak “kolondaki bir veya sınırlı sayıda bakterinin büyümesini ve/veya aktivitesini seçici olarak uyararak konakçıyı faydalı bir şekilde etkileyen ve böylece konakçı sağlığını iyileştiren sindirilemeyen bir gıda bileşeni” olarak tanımlanmıştır (Gibson vd. 1995, 2004). 2′-FL, tüm kriterleri karşılayan ve yararlı bakterilerin büyümesini seçici olarak uyarmak için prebiyotikler gibi davranan en basit fukosile oligosakkaritlerden biridir (Şekil 2A). 2′-FL, bebek bağırsak mikroplarının dört ayrı temsilci suşunun in vitro yetiştirme ortamında bir supplement olarak test edilmiştir. Bifidobacterium longum JCM7007 ve ATCC15697, kısa zincirli yağ asitleri ve laktat üretimi ile birlikte 2′-FL’yi verimli bir şekilde kullanmakta ve oluşturulan düşük pH koşulu, bir prebiyotik temel özelliğini sergileyerek Escherichia coli K12 ve Clostridium perfringens’in gelişmesini engellemektedir (Yu vd. 2013). Ayrıca, küçük kütleli fukosile oligosakkaritler, tercihen Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697 tarafından tüketilebilmektedir (Locascio vd. 2007, 2009). 2′-bağlı fukosile oligosakkaritlerin anne sütüyle beslenen bebeklerde diyare insidansını önemli ölçüde azaltabileceği bildirilmiştir (Newburg vd. 2004). Birincil neden, 2′-FL veya benzeri 2′-bağlı fukozun, E. coli tarafından kararlı bir şekilde üretilen toksini inhibe etmesi ve toksin kaynaklı sekretuar diyare riskini önlemesi olabilir (Newburg vd. 1990). Ayrıca 2′-FL içeren sütle emzirilen bebekler, 2′-FL içermeyen sütle beslenen bebeklere göre daha yüksek Bifidobakteri popülasyonları göstermektedir (Lewis vd. 2015).

Yapışma Önleyici Antimikrobiyaller

Birçok belge, fukosile oligosakkaritlerin yapışma önleyici antimikrobiyal etkisini bildirmiştir (Şekil 2B). α-1,2-Fukosile oligosakaritlerin, UEA-I ile Std fimbriaların Caco-2 hücrelerine bağlanmasını engellediği gösterilmiştir. Std operonu, çekum mukozasında α-1,2-fukosile bir oligosakkarit reseptörüne bağlanan bir adezin kodlar (Chessa vd. 2009). Ayrıca fukosile oligosakkaritler, Campylobacter jejuni’nin H(O) kan grubu epitopuna  yapışmasını da engeller ve enfeksiyon riskini azaltır (Ruiz-Palacios vd. 2003). Anne sütü ile beslenen bebeklerin tükettiği 2′-FL miktarı, Campylobacter diyare insidansı ile ilişkilidir (Morrow vd. 2004). Ayrıca 2′-FL bir antifungal modülatör görevi görür ve Candida albicans’ın insan bukkal epitel hücrelerine yapışmasını engeller (Cravioto vd. 1991). Yakın zamanda, HMO’ların bileşiminin HIV ile enfekte olmuş ve HIV’e maruz kalmış-enfekte olmamış (HEU) bebeklerin hayatta kalmasını etkileyip etkilemediği araştırılmıştır. Sonuçlar, α-1-2 fukosile oligosakkaritlerin daha yüksek konsantrasyonlarında anne sütüyle beslenen bebeklerin daha düşük ölüm oranıyla sonuçlandığını ortaya koymuştur (Kuhn vd. 2015).

İmmünomodülasyon Fonksiyonu

HMO’ların bebeğin bağırsak mikrobiyal ortamını değiştirdiği bilinmektedir ve en son in vitro sonuçlar, HMO’ların doğrudan bağışıklık tepkilerini modüle ettiğini göstermiştir (Bode 2012). 2′-FL’nin bağışıklık çalışması üzerindeki etkisini belirlemek için iki grup deney faresi seçilmiştir. 2′-FL; yapışık invaziv E. coli (AIEC) tarafından kolonizasyonun azaltılmasında, AIEC ile indüklenen CD14 ekspresyonunu modüle etmede ve proinflamatuar indüklenen sinyalleşmeyi inhibe etmede etkiliydi (He vd. 2016). Ayrıca, 2′-FL eklenmiş bebek mamalarının bağışıklık aktivitesi üzerindeki etkilerini araştırmak için 400’den fazla sağlıklı tekil bebek üzerinde bir deney gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar 2′-FL takviyesinin; aktifleşmiş CD8+ T hücrelerinin oranını yükselttiğini, inflamatuar sitokin üretimini azalttığını ve tek 2′-FL diyetinin bebeklerde bağışıklık gelişimini arttırdığını belirtmişlerdir (Goehring vd. 2016) (Şekil 2C).

Beyin Gelişimi İçin Besinler

2′-FL’nin genellikle yenidoğan döneminde bağışıklık ve bağırsak sağlığı ile ilgili fonksiyonel etkileri olduğu kabul edilmekte ve bilişsel yetenekler üzerindeki etkisi hakkında daha az bilgi bulunmaktadır. 1990’larda, 2′-FL’nin hipokampal uzun süreli potansiyasyonu (LTP) arttırdığına dair bir rapor bulunmaktadır (Matthies vd. 1996), ancak 2′-FL’nin emzirilen yenidoğanda bilişsel yeteneklerin geliştirilmesinden esas olarak sorumlu olduğunu kanıtlamak için daha fazla deneye ihtiyaç vardır. İlk kez Vazquez grubu, kemirgenlerde öğrenme ve hafıza yetenekleri üzerine oral olarak uygulanan 2′-FL ile ilgili bir dizi in vitro deney gerçekleştirmiştir. Özetle, 2′-FL tüketen hayvanlar, kontrollerden açıkça daha iyi davranışlara sahip bulunmuş ve bu 2′-FL’nin bilişsel alanları etkilediğini, öğrenme ve hafıza yeteneklerini desteklediğini göstermektedir (Vazquez vd. 2015). Ertesi yıl, 2′-FL’nin beyin gelişimi üzerindeki etkisini test etmek için sıçanlarda başka bir oral takviye deneyi gerçekleştirilmiştir. 2′-FL eklenmesinin hem çocuklukta hem de yetişkinlikte etki göstererek beyin gelişimini artırabileceği belirtilmiştir (Şekil 2D) (Oliveros vd. 2016).

2′-FL’nin ticarileştirilmesi ve uygulanması

Yukarıda bahsedilen üstün fizyolojik etkilerinden dolayı, bol miktarda bulunan HMO (2′-FL), özellikle bebek maması olmak üzere farmasötik ve gıda endüstrilerinde potansiyel uygulamaya sahiptir. Anne sütünün yenidoğanların gelişiminde hayati bir rol oynadığı evrensel olarak bilindiğinden, insan sütüne daha çok benzeyen güçlendirilmiş formül sütün geliştirilmesinde yeni atılımlar araştırılmaktadır (Faijes vd. 2019). Son yıllarda 2′-FL, ABD’de Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından (FDA, GRN 650) “Genellikle Güvenli Olarak” (GRAS) ve Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi (EFSA) tarafından yeni bir gıda (NF) olarak (EU, 2017/2470) onaylanmıştır. Sadece bebek formüllerine eklenen gıda bileşeni olarak değil, aynı zamanda diyet takviyeleri ve tıbbi gıdalar olarak da kullanılmasına izin verilmektedir (Bych vd. 2019). İlk düzenleyici izin Glycom A/S tarafından kimyasal sentezle üretilen iki HMO, 2′-FL ve LNnT için Eylül 2015’te ABD’de alınmıştır. 2016 yılında Glycom A/S tarafından mikrobiyal fermantasyon ile üretilen 2′-FL onaylanmıştır. Şuanda Glycom A/S (Esbjerg, Danimarka), BASF Corporation (Ludwigshafen, Almanya), DuPont (Wilmington, ABD), Glycosyn (Gracefield, Yeni Zelanda) ve Jennewein Biotechnologie GmbH (Rheinbreitbach, Almanya) dahil olmak üzere beş şirketten FDA ve/veya EFSA tarafından ondan fazla 2′-FL ile ilgili onay bulunmaktadır. Bu girişimciler ve bilim adamları, 2′-FL ticarileştirmesinin geliştirilmesi için büyük çaba sarf etmişler ve 2′-FL ile ilgili ürün araştırmalarını ve yeni ürün geliştirmeyi tetiklemişlerdir. 2′-FL içeren ilk bebek maması ürünü 2016 yılında piyasaya sürülmeye başlanmış ve ardından 2′-FL içeren bebek maması olmayan ürünler de ortaya çıkmaya başlamıştır. Abbott ve Nestle, HMO’ları (özellikle 2′-FL) bebek formülüne eklemenin öncüleridir. Açıkçası, 2′-FL bebek maması endüstrisinde umut verici bir pazar potansiyeline sahiptir ve şimdi yeni uygulamalar geliştirmenin en iyi zamanıdır. 2′-FL endüstriyel olarak üretilmiş ve formül süt ürünlerine başarılı bir şekilde dahil edilmiş olmasına rağmen, 2′-FL’nin makul bir fiyata elde edilmesi zor olmaya devam etmektedir. Ekonomik bir bakış açısından, 2′-FL’nin üretim maliyeti, çeşitli sentez yöntemleri geliştirilerek azaltılabilir.

2′-FL’nin kimyasal üretimi

Şimdiye kadar kimyasal, kemo-enzimatik ve hücre fabrikası yöntemleri dahil olmak üzere 2′-FL üretmek için üç yaklaşım uygulanmıştır. 1980’lerin başında kimyasal sentez yöntemiyle 2′-FL üretimi hakkında ilk rapor bulunmaktadır (Abbas vd. 1981) ve 2′-FL, kısmen benzillenmiş laktoz türevleri gibi benzilasyon substratı ile sentezlenmiştir (Fernandez-Mayoralas ve Martin-Lomas 1986). Ancak bu yöntemler, glikosilasyon reaksiyonu için daha pahalı ve toksik reaktifler gerektirir. Önceki kimyasal sentezle karşılaştırıldığında, Pereira ve McDonald (2012) 2′-FL’nin kimyasal sentezi için toksik stokiyometrik metal reaktifleri değiştirmek için daha hafif reaksiyon koşulları ve daha az toksik reaktif kullanmışlardır (Pereira ve McDonald 2012). Yakın zamanda Agoston vd. Glycom A/S şirketinden, kilogram ölçekli 2′-FL üretmek için yalnızca tek bir kromatografik saflaştırma prosedürüne ihtiyaç duyan ve endüstriyel ortam gereksinimlerini karşılayan bir kimyasal sentez yöntemi kurmuştur. Daha spesifik olarak, fukosil donörü (1-S-fenil donörü), dört aşamalı bir reaksiyonla ticari L-fukozdan hazırlanmış ve laktoz alıcısı rutin iki aşamalı bir reaksiyonla elde edilmiştir. Son glikosilasyon ve koruyucu grubun uzaklaştırılması reaksiyonlarından sonra sonuçlanan 2′-FL, yüksek saflıkta ve büyük miktarlarda elde edilebilir (Agoston vd. 2019).

2′-FL’nin Biyolojik Üretimi

Enzimatik Üretim

Genel olarak 2′-FL’nin enzimatik sentezi, glikosentaz aktivitesine sahip fukosiltransferazlar ve α-L-fukosidazlar olmak üzere iki farklı enzim türü ile glikosilasyon reaksiyonları gerçekleştirmeyi gerektirmektedir (Faijes vd. 2019). Fukosiltransferazlar, fukosilasyon reaksiyonunu tamamlamak için bir nükleotid donör substratını (GDP-fukoz) laktoza transfer edebilir. 2′-FL’nin in vitro sentezi üzerinde çok önemli bir çalışma iki aşamalı enzimatik kataliz ile rapor edilmiştir. Burada GDP-fukoz ilk olarak %78 verimle rekombinant GDPmannoz 4,6-dehidrataz (Gmd) ve GDP fukoz sentetaz (WcaG) kullanılarak GDP-mannoz ve NADPH’den üretilmiş ve ayrıca α-1,2-fukosiltransferaz (FucT2) tarafından miligram ölçeğinde %65 verimle 2′-FL’ye dönüştürülmüştür (Albermann vd. 2001). 

α-L-Fukosidazlar; tutucu glikozil hidrolaz ailesi 29 (GH29) ve tersine çeviren α-L-fukosidazlar (GH95) olarak sınıflandırılır (Lombard vd. 2014). Son yıllarda araştırmacılar, α-L-fukosidazlar tarafından fukosilasyon reaksiyonunun etkinliğini geliştirmeye çok dikkat etmişlerdir (Sakurama vd. 2012; Saumonneau vd. 2016; Sugiyama vd. 2016; Wada vd. 2008). Yedi yeni GH29 α-L-fukosidaz kodlayan gen, metagenomdan taranmış ve E. coli’de eksprese edilip tanımlanmıştır. Aralarında Mfuc5, donör olarak 25mM pNP-Fuc ve alıcı olarak 100mM laktoz kullanılarak %3.6 verimle FL üretebilmiştir. Thermotoga maritima α-L-fucosidase, alıcıda maksimum %6.4 verimle 2′-FL üretebilirken: donör oranı 4’tür (Lezyk vd. 2016). Ters çeviren glikosidazdan türetilen bir α-1,2-L-fukosidaz, 2′-FL’yi β-L-fukosil florür triasetat ve laktozdan sentezleyebilir. Çeşitli mutasyonlar tasarlanmış ve test edilmiştir ve D766G, 2′-FL için en sentetik etkinliğe sahiptir (Wada vd. 2008). Ancak 2′-FL’nin büyük ölçekli sentezi için reaksiyon verimliliği hala düşüktü. Sekiz yıl sonra, Sugiyama ve meslektaşları, N423H ve N423D/D766N mutantlarının sırasıyla pH 5.5 ve 5.0’da en yüksek aktiviteyi gösterdiğini ve 2′-FL üreten her iki mutantın sentaz aktivitesinin daha önce rapor edilen mutant D766G’den önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulmuşlardır. Hem N423H hem de N423D/D766N mutantları yaklaşık olarak 8.5mM 2′-FL üretebilmişlerdir oysa mutant D766G, 10mM β-fukosil florür ve 10mM laktoz varlığında 2′-FL’yi 1mM’den daha az üretmiştir (Sugiyama vd. 2016). 

Hücre Fabrikası Sentezi

Günümüzde metabolik mühendislik, ucuz malzemelerden değerli kimyasalların üretimi için mikrobiyal hücre fabrikalarının geliştirilmesinde giderek önemli roller oynamaktadır (Chae vd. 2017). HMO üretimi için geniş bir kullanıma sahip umut verici bir stratejidir. Sentetik biyoloji, sistem biyolojisi araçları ve modüler metabolik yol düzeneği gibi hedef ürünlerin verimini maksimuma çıkarmak için çeşitli gelişmiş araçlar araştırılmıştır (Faijes vd. 2019). 2′-FL’nin hücre fabrikası stratejisi tarafından biyosentezi, HMO’ların üretimi için en iyi durumdur. Genelde 2′-FL’nin biyosentezi, fukosiltransferazların varlığında bir glikosilasyon reaksiyonu gerektirir. Fukosiltransferazların alıcısı olarak laktoz kullanılması hücre fabrikasında laktozu daha verimli kullanmak için yaygın stratejiler; içselleştirilmiş laktozu iyileştirmek için laktoz permeazın (LacY) aşırı ekspresyonunu ve laktoz katabolizmasını azaltmak için galaktosidaz (LacZ) aktivitesinin inhibisyonunu içerir. Fukosiltransferazların donörü olan GDP-fukoz, de novo ve kurtarma yolu olmak üzere iki tür yolla sentezlenebilir (Şekil 3). 

Şekil 3. GDP-fukozun de novo yolu ve kurtarma yolu aracılığıyla E. coli’de 2′-FL’nin tüm hücre biyosentezi için metabolik yollar.

Genellikle de novo yol için ilk adım, ara GDP-4-keto-6-deoksi-mannozun oluşumuna yol açan GDP-mannoz-4,6-dehidrataz (GMD) tarafından katalize edilen bir dehidrasyon reaksiyonudur. GDP-fukoz, son aşamada iki işlevli bir enzim GDP-4-keto-6-deoksi-mannoz-3,5-epimeraz/4-redüktaz (WcaG) tarafından sentezlenir. Kurtarma yolu, ilk önce fukokinaz tarafından fukoz-1-P’ye fosforile edilen ve ardından GDP-fukoz pirofosforilaz tarafından GDP-fukoz üretmek için guanozin trifosfat (GTP) ile birleştirilen eklenmiş fukozdan başlar (Mattila vd. 2000). 

Çeşitli tasarlanmış konakçı suşları tarafından hücre fabrikası stratejisi kullanılarak 2′-FL biyosentezinin karşılaştırılması Tablo 1’de gösterilmiştir. E coli, 2′-FL üretiminde GDP-fukoz üretimi için en yaygın konaktır, çünkü de novo yolunun endojen GDP-fukoz sentezi gen kümesini içermektedir. Samain grubu, H-Antijen ile ilgili oligosakkaritleri üretmek için E. coli’yi tasarlamıştır (Drouillard vd. 2006; Dumon vd. 2006).  2′-FL üretimine gelince, α-1,2-fukosiltransferaz, lacZ ile inaktive edilmiş konakçı E. coli JM107’de eksprese edilmiştir. GDPfukoz akışını optimize etmek için, onlar kolanik asit operatörü için pozitif bir düzenleyici olan rcsA genini aşırı exprese etmişler ve GDP-fukozdan kolanik aside dönüşümü katalize eden enzimi kodlayan wcaJ genini ortadan kaldırmışlardır. 2′-FL’nin son konsantrasyonu gram ölçeğindeydi (Drouillard vd. 2006). GDP-fukozu 2′-FL sentezi için kullanılabilir hale getirmek için Seo ve meslektaşları, guanozin nükleotidlerin biyosentetik yollarını ve GDP-mannoz metabolizması yollarını modüle etmişler ve GDP-fukoz üretimini artırmak için kofaktör NADPH geri dönüşüm yolunu ortaya çıkarmışlardır (Byun vd. 2007; Lee vd. 2009, 2011, 2012a, 2013).  

Tablo 1. Çeşitli tasarlanmış konak suşları tarafından hücre fabrikası stratejisi kullanılarak 2′-FL biyosentezinin karşılaştırılması.

E. coli BL21, GDP-fukoz biyosentezinin de novo yolu aracılığıyla gliserol ve laktozdan 2′-FL üretmek üzere tasarlanmıştır (Lee vd. 2012b). 2′-FL üretimini geliştirmek için, endojen lac operon, β-galaktosidaz aktivitesini azaltmak için modifiye lac operon ile değiştirilmiş, bu da laktoza dayalı olarak 6.4 g/L’lik 2′-FL titresi ve 0.225 g/g verimle sonuçlanmıştır (Chin vd. 2015). Başka bir çalışmada, de novo yolunda yer alan manA, manB, manC, gmd ve wcaG genleri ve sırasıyla Helicobacter pylori α-1,2-fukosiltransferaz (FutC), laktoz permeaz (LacY), glukoz-6-fosfat dehidrojenaz (G6PDH), membrana bağlı transhidrojenaz (PntAB) ve kolanik asit üretimi düzenleyicisini kodlayan seçilmiş genler futC, lacY, zwf, pntAB ve rcsA E. coli BL21(DE3) içinde aşırı exprese edilmiştir. Ayrıca wcaJ, lacZ ve lon genleri çıkarılmış ve tasarlanmış suşlar 9.12 g/L 2′-FL üretebilmiştir (Huang vd. 2017). Baumgartner vd. E. coli JM109 suşlarında de novo ve kurtarma yollarında yer alan ilgili genleri kromozomal olarak entegre ederek etkili bir kombine üretim stratejisi geliştirmişlerdir. Bu yaklaşımda, futC ile birlikte de novo ve kurtarma yolu genlerinin stabil ekspresyonuna sahip hücreler, GDP-fukoz sentezi için sadece de novo yolu olan hücrelere kıyasla yaklaşık olarak iki kat daha fazla 2′-FL üretmişlerdir (380’e karşı 200 mg/g CDW). 2′-FL’nin daha da geliştirilmesi 13.5-L beslemeli kesikli fermantasyonunda 20.28 g/L titre ile futC geninin ilaveten eksprese edilmesiyle tasarlanmış E. coli konakçısında yapılmıştır (Baumgartner vd. 2013).

Chin vd. (2016) kurtarma yolunda yer alan genleri; tasarlanmış E. coli’nin 2′-FL üretmesine izin vermek için Bacteroides fragilis’den fukokinaz/GDP-fukoz pirofosforilazı (Fkp) kodlayan fkp genini ve Helicobacter pylori’den α-1,2-fukosiltransferazı kodlayan fucT2 genini uygulamışlardır. Ayrıca, fukoz izomeraz (FucI) ve fuküloz kinazı (FucK) kodlayan gen kümesi fucI-fuck ve gen lacZ, 2′-FL üretimini daha da arttırmak için çıkarılmış ve beslemeli-kesikli fermantasyon geliştirmede 23.1 g/L’nin titresi 2′-FL oluşumu ile sonuçlanmıştır. B. Fragilis’den fkp geni ve fucT2 geninin aşırı eksprese edilmesi ve lacZ, fucI ve fucK genlerinin çıkarılmasına ilaveten Jung vd. (2019) ayrıca L-arabinoz izomerazı kodlayan araA genini ve L-ramnoz izomerazı kodlayan rhaA genini elimine ederek 47.0 g/L titre ile 2′-FL üretimine yol açmışlardır (Jung vd. 2019). E. coli dışında, 2′-FL üretmek için konakçı olarak birkaç GRAS durumunda mikroorganizma seçilmiştir. Kurtarma yolu ile ilgili genin (fkp) aşırı expresse edilmesiyle tasarlanmış Saccharomyces cerevisiae’de 2′-FL üretmek için yeni bir girişim uygulanmıştır. Kluyveromyces lactis ve fucT2’den elde edilen LAC12 genleri de 2′-FL’yi biyosentezlemek için S. cerevisiae’de expresse edilmek üzere seçilmiştir. Fermantasyon sonucu tatmin edici olmasa da, bu gıda-sınıfı maya S. cerevisiae kullanılarak 2′-FL üretimine ilişkin ilk rapordur (Yu vd. 2018). Son yıllarda Hollands vd. hem S. cerevisiae hem de Yarrowia lipolytica’nın GDP-mannozdan GDP-fukoza de novo yolu aracılığıyla 2′-FL üretmek üzere tasarlanabileceğini göstermiştir. K. lactis’ten alınan alıcı laktozu aşırı eksprese eden LAC12 geni ve çeşitli organizmalardan α-1,2-fukosiltransferazları kodlayan genler, 2′-FL’nin biyosentezini tamamlamak için kullanılmıştır. Ayrıca mayadan 2′-FL elde etmek için birkaç farklı taşıyıcı kaynağı tanımlanmıştır. Neurospora crassa selobiyoz taşıyıcı (CDT2), 2′-FL akışı için kullanılan en iyi seçenek olarak seçilmiştir. Nihai mühendislik ürünü S. cerevisiae ve Yarrowia lipolytica sırasıyla 15 ve 24 g/L titrelerle 2′-FL üretebilir (Hollands vd. 2019). Tipik bir GRAS suşu olarak, bir konakçı Bacillus subtilis de etkili bir 2′-FL üretimi için geliştirilmiştir. Yazarlar, GDP-fukoz üretimi için kurtarma yolu genlerinin tanıtılması, şeker taşıyıcı kodlayan glcP ve laktoz permeaz kodlayan gen LAC12’nin aşırı ekspresyonu, bypass yolunda yer alan guaC, yfkN ve yesZ genlerinin devre dışı bırakılması ve guanozin 50-trifosfat (GTP) kofaktör rejenerasyonu sistemlerinin tasarlanması ile mühendislik ürünü B. subtilis’i düzenlemişlerdir. Nihai mühendislik ürünü B. subtilis, 3-L beslemeli kesikli biyoreaktörde 5.01 g/L 2′-FL sentezleyebilir (Deng vd. 2019a). 2′-FL üretimini geliştirmek için dinamik metabolik mühendislik için aptamer temelli bir düzenleyici mekanizma geliştiren aynı yazar tarafından başka bir strateji gerçekleştirilmiştir (Deng vd. 2019b). 

Sonuçlar ve Geleceğe Bakış

2′-FL, gıda geliştiricileri tarafından yalnızca bebek formüllerine eklenen bir gıda bileşeni olarak değil aynı zamanda diyet takviyeleri ve tıbbi gıdalar olarak da kullanılabilen çok yönlü bir bileşendir. Anne sütünün yeni doğanlara sayısız fayda sağlayan yeri doldurulamaz biyolojik işlevleri nedeniyle, anne sütünü daha yakından taklit eden bebek maması geliştirmek giderek daha acil ve önemli hale geliyor. Özellikle, 2′-FL’nin yoğun talebi 2′-FL üretimini hızlandırmıştır. Şu anda kimyasal, kemo-enzimatik ve hücre fabrikası yöntemleri dahil olmak üzere 2′-FL üretmek için üç yöntem uygulanmaktadır. Endüstriyel ölçekte 2′-FL üretimi için kimyasal yöntem, çoğunlukla düşük stereoseçicilik ve toksik çözücülerin kullanımı nedeniyle çok pratik değildir. Kemo-enzimatik yaklaşım esas olarak gerekli enzimler ve maliyetli substratlar ile sınırlı olabilir. Metabolik mühendislik ve sentetik biyoloji stratejilerinin geliştirilmesi sayesinde, 2′-FL üretimi için hücre fabrikası yaklaşımı daha umut verici bir alternatif sunuyor. Ve birçok başarılı vaka, tasarlanmış suşlar aracılığıyla yüksek miktarda üretmenin mümkün olduğunu göstermiştir.

Şimdiye kadar E. coli, 2′-FL üretmek için tasarlanmış konakçı olarak en yaygın şekilde kullanılmaktadır. E. coli kullanılarak hücre fabrikası yaklaşımıyla bir dizi arzu edilen sonuç elde edilmiştir. Yine de, çok boyutlu stratejilerden 2′-FL üretimini geliştirmek için daha fazla çaba gösterilmelidir. GDP-fukoz çok önemli ve maliyetli bir öncüdür. Takviye edilmiş fukoz ile kurtarma yolu 2′-FL sentezinin maliyetini artırabilirken pahalı olmayan substratlara sahip de novo yolu genellikle düşük verimlere sahiptir. Üretim maliyeti ve verimlilik arasındaki dengeli değerlendirme önemli bir konudur. FucT, 2′-FL’nin verimli üretimini engelleyen hız sınırlayıcı bir enzim olarak kabul edilmektedir. Gelişmiş protein mühendisliği, FucT’nin katalitik verimliliğini artırmak için iyi bir strateji olabilir. Ayrıca kofaktör mühendisliği stratejileri kullanılarak kofaktörlerin etkin temini ve spesifik geri beslemeye dirençli genler kullanılarak ara metabolitlerin geri besleme inhibisyonunun hafifletilmesi, 2′-FL’nin verimli sentezi için büyük öneme sahiptir. Son zamanlarda, gıda sınıfı B. subtilis ve mayalar S. cerevisiae ve Y. lipolytica, 2′-FL’yi sentezlemek için başarıyla tasarlanmıştır. Onların gıda güvenliği ve akış-aşağı izolasyon ve saflaştırma açısından toksin üreten bakterilere göre bir avantajı bulunmaktadır. Bu tasarlanmış suşlar 2′-FL’yi biyosentezleme yeteneğine sahip olsalar da verimler uygulanabilir pratiklik için hala elverişsizdir. Bu rapor edilen gıda sınıfı suşlar genellikle laktoz substratının kullanımı için etkili endojen laktoz permeazlarından yoksundur. Böylece 2′-FL verimini arttırmaya yönelik uygulanabilir bir strateji, laktoz kullanımını geliştirmek için laktoz permeazın yönlendirilmiş evrimidir.