Christensenellaceae, Porphyromonadaceae ve Rikenellaceae’nin Yüksek Bağırsak Mikrobiyom Bolluğu, İtalyan Yaşlılarında Azalmış Viseral Yağ Dokusu ve Daha Sağlıklı Metabolik Profil İle İlişkilidir

ÖZET

Yaşlanmaya; hastalık ve yaşam kalitesi üzerinde etkileri olan kas kütlesi yerine yağ kütlesi birikimi de dahil olmak üzere vücut kompozisyonunu ve işlevselliğini etkileyen fizyolojik değişiklikler eşlik etmektedir. Son zamanlarda, bağırsak mikrobiyomu sağlıklı yaşlanmayı ve muhtemelen uzun ömürlülüğü modüle edebilen insan sağlığının önemli bir çevresel değiştiricisi olarak ortaya çıkmıştır. Ancak bağırsak mikrobiyomunun yaşlılıktaki şişmanlık ile ilişkileri hala tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, NU-AGE çalışmasından 201 İtalyan yaşlı denekten oluşan iyi karakterize edilmiş bir kohortta 16S rRNA amplikon dizileme ile bağırsak mikrobiyotasının profilini çıkardık. Daha sonra viseral ve subkutan yağ dokusuna odaklanarak çift enerjili X-ışını absorpsiyometrisinden (DXA) vücut kompozisyonu ile ilişkini test ettik. Beslenme modelleri, serum metabolomu ve sağlıkla ilgili diğer parametreler de değerlendirilmiştir. Bu çalışma; DXA parametreleri, diyet, metabolik profiller ve kardiyo-metabolik risk faktörleri ile ilişkili yaşlı bağırsak mikrobiyotasının farklı bileşim yapılarını tanımlamıştır.

Giriş

Bağırsak mikrobiyomu; gıda parçalanması, enerji alımı ve bağışıklık sistemi işlevselliğinin düzenlenmesi üzerindeki etkisi aracılığıyla bireysel sağlığın çok önemli bir bileşenidir.^1–3 Son zamanlarda insan bağırsağı mikrobiyomu; iltihaplanmayı (yani, yaşın ilerlemesini karakterize eden düşük dereceli kronik iltihaplanma), bağışıklık yaşlanmasını, bağırsak geçirgenliğini ve bilişsel ve kemik sağlığındaki düşüşü önleyerek sağlıklı yaşlanmanın bir belirleyicisi olarak öngörülmüştür, böylece homeostazın korunmasına yardımcı olmaktadır.^4-9

Genel olarak yaşlı tip bağırsak mikrobiyomunun; fırsatçı bakterilerin ve potansiyel patojenlerin artan temsili ve konak metabolik ve immünolojik homeostaz için anahtar sinyal molekülleri olan kısa zincirli yağ asitleri (SCFA’lar) üretebilen mikropların nispi bolluğunun azalmasıyla değişmiş çeşitlilik ile karakterize edildiği bildirilmektedir.^5,10 İlginç bir şekilde, bahsi geçen mikrobiyom modifikasyonlarının uzun ömürde devam ettiği bulunmasına rağmen, insan ömrünün en uç sınırına ulaşan bireylerde (yani yarı-süper asırlık >105 yaşında) bazı özellikler yani sağlıkla ilişkili taksonlar; Bifidobacterium, Akkermansia ve Christennellaceae’nin zenginleşmesi ve/veya daha yüksek prevalansı olduğu ortaya çıkmıştır.¹¹  Yaşa bağlı bu mikrobiyom yapılarının nasıl ve özellikle ne zaman oluştuğu henüz netlik kazanmasa da, aşırı yaşlı insanlarda sağlığı geliştirici mikropların artan temsilinin sağlıklı yaşlanma ve uzun ömürlülüğün bir tür evrensel mikrobiyom imzası olarak coğrafya için sıhhatli göründüğünü belirtmekte fayda vardır.¹²

Yaşlanma; vücut kompozisyonunda genellikle kas kütlesi yerine daha yüksek yağ kütlesi seviyeleri ile sonuçlanan hastalık ve yaşam kalitesi açısından kritik etkileri olan bir dizi değişikliği içermektedir.^13-17 Yaşlanmanın vücut kütle dağılımını nasıl etkilediğini araştıran önceki çalışmalar; kas dokusunun, beyin, böbrekler, karaciğer ve dalak gibi yüksek metabolizma hızına sahip organların kütlesinin yaşla birlikte azaldığını karın bölgesinin ise yağ depolamaya daha yatkın olduğunu göstermiştir.^14,18 

Aslında yaşlılar deri altı yağ kütlesini kaybederken kaslarda, karaciğerde ve iç organlarda yağ damlacıkları olarak yağ biriktirme eğilimindedirler.¹⁵ Yaşa bağlı yağ birikimi kardiyovasküler hastalık, insülin direnci ve tip 2 diyabetin başlamasına katkıda bulunabilecek proinflamatuar bir durumdaki artışla ilişkilendirilmiştir.^19,20 Özellikle kanıtlar, derialtı yağ dokusu (SAT) birikiminden ziyade aşırı viseral yağ dokusunun (VAT) aterosklerotik kardiyovasküler olayların nedenini temsil ettiğini ve metabolik sendromun ana kaynağı olduğunu göstermiştir.^21,22

Yağ kütlesi birikiminin de bağırsak mikrobiyotasıyla bağlantılı olduğu iyi bilinmektedir. Hayvan modellerinde çığır açan çalışmalar, obez farelerden zayıf farelere mikrobiyal transplantasyonun kilo alımını indükleyebildiğini ortaya koymuştur.^23,24 Daha yakın zamanlarda insan deneklerdeki bulgular; zayıf ve obez bireylerde, erkekler ve kadınlar arasındaki farklılıklarında, bileşim ve çeşitlilik açısından belirli bir bağırsak mikrobiyal imzasına sahip olduğunu göstermiştir.^25-28

Ayrıca, ikizlerden oluşan bir kohortta yürütülen bugüne kadarki en büyük bağırsak mikrobiyota-obezite çalışmalarından birinde yazarlar, kardiyovasküler riskle ilgili şişmanlığın bileşenlerinde önemli bir rol oynayabilecek kalıtsal mikropların varlığını öne sürmüşlerdir.²⁹ Ancak bu çalışmalar çoğunlukla yaygın bir yaş aralığına sahip bireyleri ele almıştır, bu nedenle yaşlılarda mikrobiyom ve yağ dağılımı arasındaki ilişkiler hala tam olarak anlaşılamamıştır.

Viseral yağı özel olarak değerlendiren ölçümler, bağırsak mikrobiyomunun abdominal yağlanmaya katkısını daha iyi keşfetmeye yardımcı olabilir. Bu bağlamda; ultrason, bilgisayarlı tomografi (BT) ve manyetik rezonans gibi farklı görüntüleme yöntemleri, VAT ve SAT’yi değerlendirebilmekte olup, BT bunu değerlendirmek için “altın standart” tekniktir. Ancak BT, radyasyona maruz kalma ve kullanılabilirlik ile sınırlıdır ve MRI, kullanılabilirlik açısından sınırlıdır. Çift enerjili X-ışını absorpsiyometrisi (DXA), moleküler düzeyde vücut kompozisyonu değerlendirmesi için “altın standart” teknik olarak kabul edilmektedir – yağ kütlesi, kemiksiz yağsız kütle ve kemik mineral içeriğinin 3 bölmeli bir modeline çevrilir ve bazı DXA cihazları android bölgesinde VAT ve SAT miktarını özel olarak tahmin etmek için gömülü algoritmalara sahiptir.^17,30 Vücut kitle indeksi (BMI) gibi dolaylı ölçümlerin aksine DXA, yağ ve yağsız kütle ve kemik yoğunluğu seviyeleri de dahil olmak üzere vücut kompozisyonunun hızlı, hassas ve doğru ancak invazif olmayan karakterizasyonuna olanak tanımaktadır.³¹

Yaşlılıkta abdominal yağlanma ve bağırsak mikrobiyomu arasındaki ilişkileri daha iyi ortaya çıkarmak amacıyla, burada EU FP7 NU-AGE projesine kayıtlı 201 İtalyan yaşlıdan oluşan bir kohortta, 16S rRNA gen tabanlı dizileme ile profillendirildiği gibi, DXA’dan türetilen VAT ve SAT ölçümleri ile bağırsak mikrobiyota yapısı arasındaki çok değişkenli ilişkiyi analiz ettik. 7 günlük gıda kayıtları ile toplanan diyet verileri ve dört kutuplu uçuş süresi kütle spektrometresine bağlı ultra performanslı sıvı kromatografisi tarafından oluşturulan serum metabolomik verileri de, makro/mikrobesinler ve abdominal yağlanma ile ilgili mikrobiyota profilleri ile metabolitlerin ilişkilerini araştırmak için analiz edilmiştir. Farklı bağırsak bakteri taksonlarının düşük VAT ve aynı zamanda dolaşımdaki metabolitlerin ve gıda alımının özgün profilleri ile ilişkili olduğunu bulduk. Sağlıklı beslenme alışkanlıklarını desteklemenin yanı sıra bağırsak mikrobiyotasını izlemek ve mümkün olduğunca modüle etmek, sağlıklı yaşlanmayı ve muhtemelen uzun ömürlülüğü desteklemek için ek bir araç olabilir. 

Sonuçlar

Yaşlılarda abdominal yağlanma ile mikrobiyom bağlantılarını araştırmak için, dışkı mikrobiyomunun profilini çıkardık ve NU-AGE FP7 AB projesi bağlamında Emilia-Romagna bölgesinden (İtalya) (kohort açıklaması için Tablo 1’e bakınız) 201 yaşlı denekten oluşan bir kohortta (101 kadın, 100 erkek; yaş aralığı, 65-79 yıl, ortalama yaş, 71.2) yağı, özellikle viseral ve subkutan yağlanmayı ve yağsız kütle kompozisyonunu tanımlayan DXA’dan türetilen parametrelerle korelasyonlarını araştırdık. Mikrobiyota veri setimiz, numune başına ortalama 75,460 (± 64,658, SD) 300-bp çift uçlu okuma ile 15,167,630 yüksek kaliteli okumadan oluşuyordu.

Tablo 1. 201 İtalyan yaşlıdan oluşan bir kohortta demografik, antropometrik, biyokimyasal ve diğer sağlıkla ilgili parametreler. Veriler, ağırlıksız UniFrac mesafelerinin PCoA’sı ile tanımlandığı gibi, üç mikrobiyom grubunun (G1’den G3’e) yanı sıra tüm kohort için gösterilmiştir (bkz. Şekil 1a). Değerler, aksi belirtilmedikçe ortalama (SD) olarak ifade edilir. P değerleri Kruskal-Wallis testi ve ardından post-hoc Wilcoxon testi ile belirlenmiştir. HOMA-IR, insülin direncinin homeostaz modeli değerlendirmesi. ns, anlamlı değil.

Genel olarak bağırsak mikrobiyal profilleri, Bacteroidetes (%8,9) ve Actinobacteria (%7,4) ile birlikte Firmicutes filumunun (ortalama nispi bolluk, %80) yüksek bir temsilini göstermiştir. Her ikisi de Firmicutes’e ait olan Ruminococcaceae (%37,5) ve Lachnospiraceae (%27,6) familyaları veri setinde en fazla temsil edilenlerdir. Cins düzeyinde, Subdoligranum (%12,5), Faecalibacterium (%7,8) ve Bifidobacterium (%4,6) en bol bulunan taksonlar olarak tanımlanmıştır (filum, familya ve cins düzeyi profilleri için Şekil S1’e bakınız).

Ağırlıksız UniFrac mesafelerinin PCoA’sı ile mikrobiyal toplulukların beta çeşitliliğini incelediğimiz zaman üç farklı birey grubu belirledik, yani G1’den G3’e (Şekil 1a). Bir dizi mikrobiyota profili içinde bu gruplar, permütasyon çok değişkenli varyans analizi (psödo-F oranı ile permütasyon testi, R2 = 0.25, p değeri = 0.0001) ile gösterildiği gibi, birbirinden önemli ölçüde farklı bir mikrobiyota yapısına sahip denek kümelerini temsil etmektedir. Üç grubun ayrılması, bağlantı yöntemi olarak Ward ile hiyerarşik kümeleme ile de doğrulanmıştır (Fisher’ın kesin testi, p değeri < 0.0001) (Şekil S2). Kümelerin kararlılığı, 0.96 (G1), 0.95 (G2) ve 0.92 (G3) olmak üzere 1000 önyüklemeden elde edilen ortalama Jaccard benzerlikleriyle desteklenmiştir. Gruplamalar ayrıca, geçersiz hipotezin reddedildiğini doğrulayarak (yani, önceden tanımlanmış üç küme arasında fark yok) (p değeri = 0.0001) (Şekil S3) ağırlıklı ve genelleştirilmiş UniFrac metrikleri ile değerlendirilmiştir.

Üç grubun gözlemlenen Amplikon Dizi Varyantlarının (ASV’ler) sayısına ve Chao1 indeksine (Kruskal–Wallis testi, p değeri = 0,05; post-hoc Wilcoxon testi, hem G1’e karşı G2 hem de G1’e karşı G3 için p değeri = 0,045) göre G2 ve G3 örneklerinin en yüksek değeri göstermesi ile alfa çeşitliliği açısından da farklı olduğu bulunmuştur (Şekil S4). Bu tür değerler mikrobiyom alanı ile ilişkilendirilmiştir; yani Şekil 1a’daki PCoA grafiğindeki numune koordinatları, üç grup arasındaki çeşitlilik farklılıklarını da yansıtmıştır (doğrusal regresyon analizi, gözlemlenen ASV’lerin sayısı için p değeri = 0.02 ve Chao1 indeksi için p değeri = 0.01). Özellikle, G1 mikrobiyomlarındaki en düşük değerlerden G2-G3 kümelerine ait örneklerdeki en yüksek değerlere kadar PCo1 boyunca çeşitlilikte kademeli bir artış gözlemledik.

Şekil 1. İtalyan yaşlılarında bağırsak mikrobiyom profilleri. a. 201 yaşlı İtalyan’ın dışkı mikrobiyota profillerinin ağırlıksız UniFrac mesafelerine dayanan Temel Koordinatlar Analizi (PCoA) grafiği. Önemli ölçüde farklı mikrobiyal topluluk yapısına sahip üç grup tanımlanmıştır (psödo-F oranı ile permütasyon testi, p değeri = 0.0001). PCoA alanındaki (yani, sırasıyla sol, sağ üst ve sağ alt kadran) kendi kendine örgütlenmelerine bağlı olarak, onlara G1, G2, G3 adını veriyoruz. Çizelgedeki daire grafikleri sadece ≥ %0.1 nispi bolluğa sahip örneklerin en az %20’sinde (yani, 40 birey) bulunan taksonlar dikkate alınarak, üç gruptaki aile düzeyindeki nispi bollukları özetlemektedir. PCoA grafiğinin altındaki ok, gözlemlenen ASV’lerin sayısı olarak tahmin edilen alfa çeşitlilik gradyanını temsil etmektedir. b. Üç mikrobiyom grubu arasında farklı şekilde temsil edilen ailelerin nispi bolluklarının kutu grafikleri. **,* sırasıyla p değeri < 0.01 ve < 0.05, Wilcoxon testi. 

Yukarıda tüm kohort için bahsedildiği gibi tüm grupların fekal mikrobiyotası, farklı oranlarda olsa bile büyük ölçüde sadece iki aile Ruminococcaceae ve Lachnospiraceae hakim olmuştur (Şekil 1b). Ruminococcaceae’nin nispi bolluğu aslında  G1’e kıyasla G3’te önemli ölçüde daha yüksekken, Lachnospiraceae’ninki G1’e kıyasla G2’de daha düşüktür (Wilcoxon testi, p değeri ≤ 0.01). Üç grubun da alt baskın ailelerde farklılık gösterdiği bulunmuştur. Özellikle G2; G1’e kıyasla Christensenellaceae ve Rikenellaceae’de ve G3’e kıyasla Porphyromonadaceae’de bir zenginleşme göstermiştir (p değeri ≤ 0.05).

Üç gruptaki katmanlaşmanın cinsiyetten, zayıflıktan (çiftli Fisher’ın kesin testi, p değeri > 0.05) ve yaştan (Kruskal–Wallis testi, p değeri > 0.05) bağımsız olduğunu dikkate almak önemlidir (bkz. Tablo 1 ve Şekil S5). Ayrıca Tablo 1’de gösterildiği gibi üç grup; fiziksel işlev, glikoz ve lipid metabolizması, karaciğer ve bilişsel işlev ile ilgili ölçülen parametrelerin çoğu için benzerdi (p değeri > 0.05). Ancak G1 ve G3’e kıyasla G2 grubundaki yaşlı deneklerde; antropometrik ölçümler (yani BMI, bel ve kalça çevresi ve bel-kalça oranı), kardiyovasküler risk faktörleri (diyastolik basınç), böbrek fonksiyon belirteçleri (kreatinin ve ürik asit) için daha düşük değerler ve adiponektin için daha yüksek değerler (anti-inflamatuar etkilere sahip adipozite-ilişkili bir sitokin) anlamlı bir biçimde gösterilmiştir (post-hoc Wilcoxon testi, p değeri < 0.05) (Tablo 1). İlaç alan deneklerin sayısı üç grupta antihipertansif ilaçlar için benzerdi (G1: %77.5, G2: %80.0, G3: %73.5) oysa G3 grubundaki daha fazla sayıda yaşlı statin almıştır (G1: %17,0, G2: %15.0 ve G3: %26,5) ve G2 grubundaki hiçbir yaşlı antidiyabetik ilaç kullanmamıştır (G1: %8,8, G2: %0 ve G3: %5,9). 

Daha sonra, üç mikrobiyom profili ile DXA’dan türetilen vücut kompozisyonu değişkenleri arasındaki ilişkileri, özellikle karın yağına odaklanarak araştırdık. G2 grubundaki yaşlılar, G1 ve G3 deneklerinden (p değeri = 0,003) önemli ölçüde daha düşük VAT seviyeleri göstermiştir oysa SAT’a göre herhangi bir farklılık gözlemlenmemiştir (p değeri = 0.2) (Şekil 2a). Buna göre VAT/SAT oranı G1 ve G3 deneklerine kıyasla G2’de önemli ölçüde daha düşüktü (p değeri < 0.05) (Şekil 2a). Adipozite ile ilgili diğer DXA değişkenleri için de tutarlı sonuçlar gözlemlenmiştir (Şekil S6). DXA meta verileri ile cins düzeyinde taksonların nispi bollukları arasındaki korelasyonlar daha sonra sPLS regresyonu aracılığıyla spesifik olarak aranmıştır (Şekil 2b ve 2c). Christensenellaceae (Christensenellaceae R7 grubu), Porphyromonadaceae (Parabacteroides) ve Rikenellaceae (Alistipes), yani G2 deneklerinin fekal mikrobiyotasında zengin olduğu bulunan familyalara ait cinsler VAT dahil bir dizi DXA değişkeni ile ters ilişkiliydi. Öte yandan, G2 grubunda oranları çok daha düşük olan Lachnospiraceae familyasının üyeleri (Eubacterium rectale grubu, Fusicatenibacter ve Blautia), özellikle yağ kütlesi dağılımı ile ilgili olanlar (yani, tüm vücut yağ kütlesi (FM), tüm vücut yağ kitle indeksi (FMI), android yağ kütlesinin android yağsız kütle oranına (AF/AL), android yağ kütlesinin jinoid yağ kütlesine oranı (AF/GF) ve VAT) dahil olmak üzere dikkate alınan DXA ölçümlerinin büyük çoğunluğu ile pozitif ilişkiliydi. Bunun yerine G3 grubunda aşırı temsil edilen bir ailesi olan Ruminococcaceae için yağlanma ile ilgili DXA değişkenlerinin çoğu üç cins (Ruminococcaceae UCG 014, 002, 005) ile negatif ve diğer üç cins (Faecalibacterium, Subdoligranum ve Ruminococcus 2) ile pozitif korelasyon gösteren  uyumsuz veriler gözlemlenmiştir. Son olarak, yağsız kütle parametresi SMI’nin (iskelet kitle indeksi, yani apendiküler yağsız kütlenin toplam vücut kütlesine oranı), hem korelasyon daire grafiğindeki konumu hem de korelasyon yönü için diğerlerinden farklı olduğuna dikkat edilmelidir. Özellikle Christensenellaceae R7 grubu ve üç Ruminococcaceae cinsi (Ruminococcaceae UCG 014, 002, 005) için doğrudan bir korelasyon gözlemlenmiştir. Öte yandan yukarıdaki gözlemlerle uyumlu olarak, Ruminococcus 2, Subdoligranulum ve Lachnospiraceae üyeleri Fusicatenibacter ve Blautia; SMI ile negatif korelasyon göstermiştir.

Şekil 2. Yaşlı bağırsak mikrobiyomu ve vücut bileşimi arasındaki ilişkiler. a. Şekil 1a’daki (yani, G1’den G3’e) ağırlıksız UniFrac-temelli PCoA tarafından tanımlanan üç mikrobiyom grubu için viseral yağ dokusu (VAT, g) ve derialtı yağ dokusu (SAT, g) ölçümlerinin kutu diyagramı ve onların oranları. **,* sırasıyla p değeri < 0.01 ve 0.05, Wilcoxon testi. b. Cins düzeyinde ve DXA değişkenlerinde mikrobiyal bollukların aralıklı kısmi en küçük kare (sPLS) regresyonu. < -0.2 ve > 0.2 için tanımlanan korelasyonlarla ilk iki sPLS bileşenleri için korelasyon daire grafiği. İki dairenin çevresi, 0.5 ve 1.0’da korelasyon katsayısı yarıçaplarını göstermektedir. Bir bakteri cinsi veya DXA ölçüsü merkezden ne kadar uzaksa, bileşenle olan ilişki o kadar büyüktür. Grafiğin aynı yönünde yansıtılan değişkenler pozitif korelasyonluyken, taban tabana zıt konumdaki değişkenler negatif korelasyonludur. Birbirine dik doğrultuda yerleştirilmiş değişkenler korelasyonlu değildir. Cinslerin açıkladığı varyans birinci bileşende %10 ve ikinci bileşende %5 iken, DXA değişkenlerinin açıkladığı varyans birinci bileşende %37 ve ikinci bileşende %42’dir. c. Tam bağlantı yöntemi ve uzaklık olarak Pearson korelasyonu ile elde edilen hiyerarşik kümeleme, korelasyon daire grafiğinde gösterilen değişkenler korunarak sPLS regresyon modelinde gerçekleştirilmiştir. Her cins için aile düzeyinde atama da gösterilmiştir (renk açıklamasına bakınız). DXA değişkenlerinin kısaltılmış adları; tüm vücut yağ kütlesi (FM), tüm vücut yağ kitle indeksi (FMI), tüm vücut yağ kütlesinin yağsız kütleye oranı (FM/LM), tüm vücut yağsız kütlesi (LM), apendiküler yağsız kütlenin toplam vücut kütlesine oranı (SMI) , tüm vücut kemik mineral içeriği (BMC), tüm vücut kemik mineral yoğunluğu (BMD), android-jinoid yağ kütlesi oranı (AF/GF), android yağ kütlesi-yağsız kütle oranı (AF/AL), viseral yağ dokusu (VAT) ve derialtı yağ dokusu (SAT) karşılık gelmektedir.

Diyet alımını değerlendirmek için yedi günlük gıda kayıtları kullanılmıştır. Sonuçlar, bireylerin vücut ağırlığına göre normalleştirilmiştir ve üç mikrobiyom grubu arasında bir karşılaştırma kolaylaştırılmıştır. G1, G2 ve G3 için besin maddelerinin diyet alımları Tablo 2’de gösterilmektedir. Enerji, doymuş ve doymamış yağ asitleri, protein ve lifin toplam alımı ve ayrıca vücut ağırlığına göre normalize edilen çoğu vitamin ve kalsiyum için önemli farklılıklar bulunmamıştır. İlginç bir şekilde, G2 grubuna ait yaşlılar önemli ölçüde daha yüksek karbonhidrat alımı (Kruskal-Wallis testi, p değeri = 0.025; post-hoc Wilcoxon testi, G1’e karşı G2 ve G2’ye karşı G3 için p değeri <0.05) ve su (Kruskal–Wallis testi, p değeri = 0.055), β-karoten (p değeri = 0.052) ve C vitamininin (p değeri = 0.054) daha yüksek seviyelere doğru bir eğilimini göstermiştir. Ayrıca, üç mikrobiyom kümesi arasında farklı gıda gruplarının ortalama günlük alımı (vücut ağırlığına standardize edilmiş) karşılaştırıldığında, G2 grubundaki yaşlılar G1’den önemli ölçüde daha düşük patates alımı göstermiş (0.10 g/gün’e karşı G1 için 0.27 g/gün, post-hoc Wilcoxon testi, p değeri < 0.05) ve G3 ile karşılaştırıldığında daha yüksek meyve ve sebze alımına yönelik bir eğilim (9.41 g/gün’e karşı G3 için 6.20 g/gün; Wilcoxon testi, p değeri = 0.058) göstermiştir (Tablo S1). Şekil 1a’da PCoA grafiğindeki gıda gruplarının ortalama günlük alımlarının bir üst üste bindirme analizi, G2 grubunun mikrobiyota profili ile peynirle birlikte daha düşük patates tüketimi (permütasyon korelasyon testi, p değeri ≤ 0.025) arasında bir ilişkiyi doğrulamıştır (Şekil S7). 

Tablo 2. Günlük ortalama enerji ve besin alımı. Tüm değerler vücut ağırlığına (kg) göre normalleştirilmiştir. Veriler, ağırlıklandırılmamış UniFrac mesafelerinin PCoA’sı ile tanımlandığı gibi, üç mikrobiyom grubunun (G1’den G3’e) yanı sıra tüm kohort için gösterilmiştir (bkz. Şekil 1a). Değerler ortalama (SD) olarak ifade edilmiştir. P değerleri Kruskal-Wallis testi ve ardından post-hoc Wilcoxon testi ile belirlenmiştir. MUFA, tekli doymamış yağ asitleri; PUFA, çoklu doymamış yağ asitleri. ns, anlamlı değil. 

Son olarak, bağırsak mikrobiyom yapılarını ayırt eden metabolitleri bulmak için serum metabolomik verileri analiz edilmiştir. G2 grubu; mineral (kükürt), BCAA’lar (izolösin, lösin ve valin), yağ asitleri (miristik asit-C14:0) ve metil ester yağ asitleri (metil-heksadekenoik asit ve tetrametil-dihidroksi-oktadekahekzaenoik asit) (G2 ve G1 ve/veya G3 için post-hoc Wilcoxon testi, p değeri ≤ 0.05) ve birincil safra asidi kenodeoksikolik asitin daha düşük seviyelerine eğilimi (p değeri > 0.05) dahil olmak üzere bazı serum metabolitlerinin önemli ölçüde daha düşük dolaşımdaki seviyeleri ile karakterize edilmiştir. Öte yandan, metil-heptadekadienoik asit G3’e kıyasla G2’de aynı zamanda G3’e kıyasla G1’de de anlamlı derecede yüksek bulunmuştur (p değeri ≤ 0.05) (Şekil 3). Cins düzeyinde ve metabolitlerde nispi bollukların bir sPLS regresyon analizine dayanarak (Şekil S8), G2 grubunun imzası olarak tanımlanan familyalara ait cinsler, yani Christensenellaceae R7 grubu, Alistipes ve Parabacteroides, BCAA’lar ile ters orantı gösterirken, G1 ve G3 profillerinden farklı olan bazı Lachnospiraceae ve Ruminococcaceae üyeleri zıt korelasyonlar göstermiştir. Benzer şekilde, yağ asitleri için Christensenellaceae R7 grubu veya Alistipes ve sPLS regresyon modelinde tutulan sistemik yağ asitlerinin çoğunluğu arasında negatif korelasyonlar gözlemledik. Buna karşılık Bifidobacterium, Streptococcus, Ruminococcus 1 ve Erysipelotrichaceae UCG 003 ile birlikte Lachnospiraceae taksonları ile çoğunlukla pozitif ilişkiler bulunmuştur. 

Şekil 3. Yaşlı bağırsak mikrobiyom grupları için ayırt edici serum metabolitleri. Dallı zincirli amino asitler (yani, lösin, izolösin ve valin), yağ asitleri (metil heptadekadienoik asit, metil-heksadekenoik asit ve tetrametil-dihidroksi-oktadekaheksaenoik asit), doymuş yağ asidi, miristik asit (C14:0), mineral kükürt (S) ve birincil safra asidi, kenodeoksikolik asitin dolaşımdaki seviyelerinin dağılımını gösteren kutu grafikleri. *, p değeri ≤ 0.05, Wilcoxon testi.

Tartışma

Bu çalışmada vücut pozisyonu ve sağlıkla ilgili diğer parametrelerle korelasyon gösteren, farklı bağırsak mikrobiyom yapıları barındıran yaşlı İtalyan bireylerinden önemli ölçüde farklı üç grup (G1’den G3’e) belirledik. Özellikle, G1 grubu daha yüksek Lachnospiraceae bolluğu ile karakterize edilmiştir, G2 grubu Christensenellaceae, Porphyromonadaceae ve Rikenellaceae’de ve G3 Ruminococcaceae’da zenginleşmiştir. Üç profil de farklı biyoçeşitlilik ile karakterize edilmiş, G2 ve G3 en yüksek seviyeyi göstermiş ve ardından G1 gelmiştir. Bağırsak mikrobiyomu ve vücut kompozisyonu arasındaki bağlantıları araştırdığımızda G2 mikrobiyom kümesinin, abdominal obezitenin belirli bir ölçüsü olan VAT’ın en düşük ortalama değerine sahip olduğunu bulduk.   

Android ve jinoid yağ için DXA verilerini kullanarak bağırsak mikrobiyomu düzeni ile yağ dağılımı arasında cinsiyete özgü bir ilişki olduğunu bildiren bir Çinli yetişkin popülasyonunda yapılan yakın tarihli bir çalışmanın aksine, çalışmamızdaki üç yaşlı grubu tanımlayan mikrobiyal topluluklar ne cinsiyet ile ilişkili ne de yaşa bağlıdır.²⁸ Ancak veri setimizin yaşlılıkla sınırlı olduğu ve android/jinoidin toplam yağ kütlesine oranının daha düşük bir aralığı ile karakterize edildiğine dikkat edilmelidir (kohortumuzdaki en düşük ve en yüksek değerler sırasıyla 4.1 ve 21.9; Çin kohortunda sırasıyla 6.6 ve 26.6’dır). 

Mevcut literatürle uyumlu olarak, G2 grubunun mikrobiyal kapladığı alan (yani, Christensenellaceae, Porphyromonadaceae ve Rikenellaceae’nin daha büyük oranı), viseral yağ kütlesi miktarının azalmasına katkıda bulunabilir.^29,32,33 Aslında, Christensenellaceae familyası viseral yağ kütlesi ile negatif ilişkili olarak sürekli rapor edilmiştir ve bizim sPLS regresyonumuz tarafından da gösterildiği gibi, yağsız fenotipin bir belirteci olarak gösterilmiştir.^29,34,35 Öte yandan her ikisi de Bacteroidetes filumuna ait olan Porphyromonadaceae ve Rikenellaceae üyeleri, SCFA’ların asetat ve propiyonat üretimi yoluyla adipozite düzenleyicileri olarak rol oynayabilir.³⁶ Spesifik olarak asetatın karaciğerde yağ asidi oksidasyonunda ilgili genleri yukarı doğru düzenleyerek farelerde yağlanmanın azalmasına katkıda bulunduğu gösterilmiştir.³⁷ Ayrıca, Christensenellaceae ve Rikenellaceae’nin bolluğunun son zamanlarda birbirleriyle yüksek oranda ilişkili olduğu ve zayıf kişilerde obez deneklere göre önemli ölçüde daha yüksek olduğu bulunmuştur.³⁸

Aksine düşük çeşitliliğe sahip, daha yüksek VAT ile ilişkili mikrobiyom profili G1’in ayırt edici özelliği bulunan Lachnospiraceae familyası diyet lipid metabolizmasına bağlanmıştır ve bu aileye ait cinsler, örn. Blautia, korelasyon analizimizde olduğu gibi daha yüksek VAT^29,39,40 miktarları ile ilişkilendirilmiştir. Öte yandan, Ruminococcaceae üyeleri için (yüksek çeşitliliğe sahip ancak VAT ile ilgili G3 grubunun belirteci), viseral yağ ile ilgili çelişkili eğilimler bulduk ancak bunlar genellikle literatürde mevcut olanlarla tutarlıdır. Örneğin, kohortumuzda VAT ile pozitif korelasyona sahip olan Faecalibacterium, bilinen anti-inflamatuar ve immünomodülatör özelliklerine rağmen, muhtemelen diğer taraftan emilemeyen karbonhidratlardan enerjiyi toplayıp artırma yeteneğinden dolayı bazen obez deneklerde artan seviyelerde bulunmuştur.^41,42 Buna karşılık, Ruminococcaceae UCG 014 ve Ruminococcaceae UCG 005 cinslerinin her ikisi de sPLS regresyonumuz doğrultusunda yağlanma^43,44  ile negatif olarak ilişkilendirilmiştir. Ayrıca, veri kümemizde SMI (bir yağsız kütle parametresi) dışında dikkate alınan tüm DXA ile ilgili değişkenlerle pozitif ilişkiler gösteren Subdoligranum’un son zamanlarda hem dışkı hem de kan metabolik profilleri ile ilişkili birkaç anahtar türden biri olarak tanımlandığını belirtmekte fayda vardır, bu nedenle bağırsak-sistemik metabolik etkileşimde büyük bir rol oynaması muhtemeldir.⁴⁵ 

İlginç bir şekilde kohortun tamamı, neredeyse tüm risk parametreleri normal aralıklarında olan görünüşte sağlıklı yaşlı deneklerden oluşurken, G2 grubundaki yaşlılar G1 ve G3’e kıyasla; BMI, bel ve kalça çevresi ve bel-kalça oranı, diyastolik basınç, kreatinin ve ürik asit gibi çeşitli antropometrik, metabolik, kardiyovasküler ve renal risk faktörlerinin önemli ölçüde daha düşük seviyesine ve anti-inflamatuar etkilere sahip adipozite ile ilişkili bir sitokin olan adiponektinin daha yüksek seviyelerine sahiptir. Bu bulgular özellikle ilgi çekicidir, çünkü özellikle G2 deneklerinde zenginleştirilmiş Christensenellaceae, asırlık ve yarı-süper asırlıkların bağırsak mikrobiyomunun önemli bir bileşeni ve genelde daha sağlıklı bir profil olarak bilinmektedir, bu nedenle erken yaşlılıktan (60-70 yaş) itibaren sağlıklı yaşlanma ve uzun ömürlülüğün bir belirtecini potansiyel olarak temsil etmekdir.^11,46,47

Ayrıca, G1 ve G3 gruplarıyla karşılaştırıldığında G2’deki yaşlılarda, insülin eksikliği ve dirençli bozukluklarla ilişkili olduğu bilinen ve VAT ile pozitif korelasyon gösterdiği zaten bilinen BCAA’ların serum düzeylerinin daha düşük olduğu gösterilmiştir.^48-50  Aynı zamanda G2 grubu, Akdeniz diyeti uygulayan bir İtalyan popülasyonunda HDL kolesterol düzeyleri ile ters bir ilişki gösterilmiş olan metil ester yağ asitleri ve miristik asitin dolaşımdaki daha düşük  seviyeleri ile karakterize edilmiştir.⁵¹ Kolesterol seviyeleri üç grupta farklı olmasa da, G2 için ortalama değerler daha düşüktür. Beklendiği gibi hem yağ asidi hem de BCAA seviyelerinin; G2 grubunun imzası olarak tanımlanan familyalara ait cinslerle, yani Christensenellaceae R7 grubu, Alistipes ve Parabacteroides ile ters, G1 ve G3 gruplarının ayırt edici özelliği olan bazı Lachnospiraceae ve Ruminococcaceae üyeleri ile pozitif korelasyon gösterdiği bulunmuştur. G2 grubundaki yaşlıların, kolesterol metabolizması üzerindeki etkisi henüz kesin olmayan ancak olumsuz olabilecek kenodeoksikolik asit düzeylerini düşürme eğilimi gösterdiğini de belirtmekte fayda vardır.⁵²  Bu, G2 ile ilişkili bağırsak mikrobiyotası tarafından sekonder safra asitlerinin daha büyük bir üretim kapasitesini düşündürebilir. Bu yeteneğin metagenomik metatranskriptomik ve dışkı metabolomikleri dahil uygun yöntemlerle doğrulanması gerekmesine rağmen, önceki raporlar G2 ayırt edici taksonların, özellikle Bacteroidetes üyelerinin, birincil safra asitlerinin ikincil olanlara dekonjugasyonu ve metabolizması yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir.^53–56 Bu hipotezi daha da güçlendiren, son zamanlarda sekonder safra asidi metabolizması ile G2 profilinin bir başka ayırt edici taksonu olan Christensenellaceae arasında güçlü bir pozitif korelasyon bulunmuştur.⁵⁷ PFAM ve NCBI veri tabanında yapılan bir araştırmaya dayanarak, Christensenellaceae türleri aslında hem safra tuzu hidrolaz (EC 3.5.1.24) hem de safra asidi degradasyonu ile ilişkili 7-dehidroksilasyon işlemine katılan safra asidi 7-alfa-dehidrataz (EC 4.2.1.106) aktivitesi sergilerler. ^58,59 

G2 grubundaki yaşlılar için daha iyi metabolik sağlığa ilişkin yukarıdaki varsayımlarla tutarlı olarak, diğer gruplara göre daha düşük patates tüketimi ve daha yüksek ortalama günlük meyve ve sebze alımı eğilimi ile onların beslenme düzenleri de daha sağlıklıydı. İlginç bir şekilde, meyve ve sebze tüketimini artırmanın ve patates alımını azaltmanın iskemik inme riskini azaltabileceği gösterilmiştir.⁶⁰ Ayrıca G2 ile ilişkili mikrobiyota profilinin, adipozite ve lipit yolakları aracılığıyla kardiyovasküler riski arttırdığı bilinen başka bir ürün olan peynirin daha düşük alımı ile ilişkili olduğu bulunmuştur.⁶¹

Özetle, burada yaşlıların bağırsak mikrobiyomunun farklı yüksek çeşitlilikteki yapılarının VAT’ın azaltılmış miktarına katkıda bulunabileceği hipotezini geliştiriyoruz. Özellikle sonuçlarımız yüksek miktarlarda Christensenellaceae, Porphyromonadaceae ve Rikenellaceae’nin viseral yağla ilgili kardiyovasküler ve metabolik hastalıkların koruyucusu olarak ve dolayısıyla sağlıklı yaşlanma ve muhtemelen uzun ömürlülüğün potansiyel belirteçleriyle ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu hipotez, daha sağlıklı bir diyet alımı ve metabolik profil ve bu mikrobiyal düzeni barındıran yaşlılar için genel olarak daha iyi sağlık ile desteklenmektedir. Bu nedenle, yaşlı insanların bağırsak mikrobiyotasının uygun bileşimlerinin; çoğunlukla iltihaplanma ile örtüşen, obezitenin neden olduğu insülin direncini ve tip 2 diyabeti tetikleyen, belirli bir metabolizmanın neden olduğu iltihaplanma olan metaflamasyonun azaltılmasına katkıda bulunabileceğini savunuyoruz.⁶²

Muhtemelen farklı coğrafi bölgelerden daha büyük kohortlarda metabolomiklerle birleştirilmiş shotgun metagenomikleri yoluyla daha ileri çalışmalar, bulgularımızı doğrulamak ve bağırsak mikropları ile VAT arasındaki ilişkinin altında yatan mekanizmalar ve bunların adipoziteyi modüle etme ve sağlıklı bir yaşamı teşvik etme rolleri hakkında bilgi sağlamak için gerekli olacaktır. Bu tür mekanizmalar muhtemelen bir hayvan modelinde doğrulanmalıdır. Benzer şekilde kültürel yaklaşımlar yoluyla ek çalışma; farklı ağların kurulmasına yol açan bağırsak mikrobiyotasındaki dinamikleri ve ekolojik kuralları daha iyi anlamak için gereklidir. Yakın gelecekte uygulanabilirliği NU AGE⁶³ bağlamında gösterilmiş olan yaşlı bağırsak mikrobiyotasının hedeflenen manipülasyonunun, vücut kompozisyonunda ve çoklu vücut fonksiyonlarında yaşa bağlı bozulmayı karşılaştırmayı amaçlayan mevcut stratejilerin ayrılmaz bir bileşeni haline geleceğini ummak mantıklıdır, böylece sağlıklı yaşlanma desteklenir.  

Materyal ve Metot

Çalışma Kohortu

NU-AGE (https://cordis.europa.eu/project/id/266486), 16 Avrupa ülkesinden beslenme, gerontoloji, immünoloji ve ve moleküler biyoloji alanında çalışan 30 işbirlikçinin yer aldığı, 2016 yılında sona eren çok merkezli bir AB FP7 projesidir. NU-AGE’nin amacı; 12 aylık kişiselleştirilmiş bir Akdeniz diyetinin (clinicaltrials.gov, NCT01754012’ye kayıtlı) bilişsel düşüş, kemik yoğunluğu, kas kütlesi, sindirim sağlığı, bağışıklık ve kardiyovasküler sistemler dahil olmak üzere yaşlanma süreci üzerindeki etkilerini incelemekti. Katılımcı kayıtları daha önce detaylı olarak tanımlanmıştır.^64,65 Kısaca, dahil etme/hariç tutma kriterleri için tarama yapıldıktan sonra, beş AB ülkesinde (Polonya, Hollanda, Birleşik Krallık, Fransa, İtalya) 65 ile 79 yaşları arasındaki 1 279 serbest yaşayan sağlıklı yaşlı kaydedilmiştir ve antropometri, beslenme durumu, vücut kompozisyonu, sağlık ve tıbbi durum, bilişsel ve fiziksel işlevler ve bir dizi biyokimyasal ve inflamatuar ölçümler ayrıntılarıyla karakterize edilmiştir.⁶⁶ Katılımcılar, Fried ve meslektaşları tarafından öngörülen kilo kaybı, zayıflık (yani, zayıf el kavrama kuvveti), kendi-kendine bildirilen bitkinlik, yavaşlık (yani, yavaş yürüme hızı) ve düşük fiziksel aktivite dahil olmak üzere beş kritere dayalı olarak zayıflık durumlarına göre sınıflandırılmıştır. Çalışmaya sadece zayıf olmayan (yukarıdaki 5 kriterin hepsinin yokluğu) ve zayıflık öncesi (kriterlerin 1 veya 2’sinin varlığı) denekler dahil edilmiştir.⁶⁷

Yazılı bilgilendirilmiş izin Helsinki Bildirgesi’ne uygun olarak, çalışmaya dahil edilmeden önce tüm katılımcılardan alınmıştır. NUAGE, koordinatör merkezin etik kurulu, S. Orsola-Malpighi Hastanesi Bologna (İtalya) Bağımsız Etik Kurulu ve diğer dört çalıştıran merkezin tüm yerel/ulusal etik kurulları tarafından onaylanmıştır.

DXA tarafından VAT ve SAT analizi sadece İtalyan yaşlılar için mevcut olduğundan, burada yeni nesil dizileme yoluyla fekal mikrobiyomun profilini çıkardığımız ve DXA değişkenleri, özellikle VAT ve SAT ile, ayrıca beslenme alışkanlıkları ve dolaşımdaki metabolitler ile korelasyonlar aradığımız sadece bu kohorta odaklandık (lütfen aşağıdaki paragraflara bakınız). Dışkı toplamaya gelince, her katılımcıdan bir dışkı örneği toplaması istenmiştir.

Numuneler hemen -20°C’de saklanmış ve Deneysel, Teşhis ve Özel Tıp Departmanına (Bologna Üniversitesi, Bologna, İtalya) teslim edilmiş ve burada işlenene kadar -80°C’de saklanmıştır.

Antropometrik, fiziksel, kardiyovasküler, klinik ve bilişsel işlev değerlendirmesi

Boy, 0.1 cm hassasiyetle bir stadiometre ile ölçülmüştür.  Ağırlık, hafif giysiler giyerek 0.1 kg hassasiyetle kalibre edilmiş bir terazi ile ölçülmüştür. Vücut Kitle İndeksi (BMI) ağırlık/boy² (kg/m²) olarak hesaplanmıştır. Bel çevresi ya gövdenin en dar çevresinden ya da alt kaburgalar ile iliak kanat arasındaki orta noktada ölçülmüştür. Kalça çevresi, kalçaların en büyük yanal uzantısı seviyesinde veya kalçaların üzerinde yatay olarak ölçülmüştür. El kavrama kuvveti baskın elde üç kez Scandidact Smedley’s Hand Dynamometer® (Odder, Danimarka) kullanılarak 0.1 kg hassasiyetle ölçülmüştür. Fiziksel performans 6 dakikalık yürüme mesafesi, Günlük Yaşam Aktiviteleri (ADL) ölçeği, Enstrümantal Günlük Yaşam Aktiviteleri (IADL) ölçeği ve PASE naire toplam puanı ile değerlendirilmiştir. Bilişsel işlev; yaşlı Muayene Cambridge Mental Bozuklukları (CAMDEX) öznel bellek puanı, Geriatrik Depresyon Ölçeği (GDS) puanı ve daha önce bildirildiği gibi Mini Mental Durum Muayenesi (MMSE) puanının uygulanmasıyla değerlendirilmiştir.⁶⁸ Kan basıncı ve kalp hızı, daha önce bildirildiği gibi otomatik ve kalibre edilmiş elektronik monitör Omron, M2 compact (Milan, İtalya) kullanılarak ölçülmüştür.⁶⁹ Reçeteli ilaçların ve takviyelerin kullanımı ve klinik öykü, bir anketle toplanmış ve görüşmeci tarafından doğrulanmıştır. Tüm ölçümler ve anketler eğitimli araştırma görevlileri tarafından alınmıştır.

Vücut kompozisyonu değerlendirilmesi

Toplam ve bölgesel vücut kompozisyonunun doğrudan ölçümleri, tüm vücut DXA taraması (Lunar iDXA, GE Healthcare, Madison, WI – enCORETM 2011 yazılım sürümü 13.6 ve tahmini VAT ve SAT için yükseltme) gerçekleştirilerek elde edilmiştir. Tarayıcılar, standart kalite kontrol prosedürleriyle uyumludur ve üreticilerin talimatları izlenerek günlük olarak yeniden kalibre edilmiştir. DXA taramaları eğitimli personel tarafından, dansitometriden önce tüm metal parçalar çıkarılarak ve denekler sırtüstü pozisyonda kolları katılımcının vücudunun yanında olacak şekilde gövdeye göre biraz boşluk bırakılarak ve tarama alanı ortalanarak gerçekleştirilmiştir. DXA şu bölgeleri taramıştır: tüm vücut, gövde, üst uzuvlar, alt uzuvlar, android bölgesi (iki üst iliak kanattan ve kafatasına doğru uzatılmış ve çene mesafesinin %20’sini kaplar) ve jinoid bölge (kalça kemiğinin büyük trokanterinden vücudun arka tarafına yönlendirilir ve android bölgesindeki mesafenin iki katını kaplar). Taranan her bölge için toplam kütle, yağ kütlesi, kemiksiz yağsız kütle ve kemik mineral içeriğinin ağırlığı (g olarak) elde edilmiştir. VAT ve SAT ölçümleri CoreScan yazılımı ile android seviyesinde elde edilmiştir. 

Bu çalışma, subkutan ve viseral yağlanma dahil olmak üzere karın bölgesinin yağ ölçümlerine odaklanarak, toplam yağ ve yağsız kütle dağılımı ve kemik mineral içeriği ile ilgili değişkenleri içermektedir: tüm vücut yağ kütlesi (FM, g), tüm vücut yağ kitle indeksi (FMI, g/m²), tüm vücut yağ kütlesinin yağsız kütleye oranı (FM/LM), tüm vücut kemiksiz yağsız kütle (LM, g), tüm vücut kemiksiz yağsız kütle indeksi (LMI, g/m²), iskelet kütle indeksi (SMI, yani apendiküler yağsız kütlenin toplam vücut kütlesine oranı), tüm vücut kemik mineral içeriği (BMC, g), tüm vücut kemik mineral yoğunluğu (BMD, g/cm²), tüm vücut T-skoru, android yağ kütlesinin android yağsız kütle oranına (AF/AL), android yağ kütlesinin jinoid yağ kütlesine oranı (AF/GF), VAT (g) ve SAT (g) ve onların oranları. 

Kan örnekleri ve biyokimyasal parametreler

Kan örnekleri, katılımcılar aç kaldıktan (en az 8 saat) ve önceki 24 saat içinde ağır egzersiz ve alkolden kaçındıktan sonra alınmıştır. Örnekler oda sıcaklığında 30 dakika bekletildikten sonra santrifüjlenmiş ve standart bir çalışma prosedürüne göre plazma ve seruma ayrılmıştır, daha sonra alikotlanmış ve analize kadar -80°C’de saklanmıştır. Enflamatuar parametrelerin değerlendirilmesi için yöntemler Santoro vd.⁶⁹‘den rapor edilmiştir. Kısaca, C-reaktif protein (CRP), leptin ve adiponektin, üreticinin talimatlarına göre Luminex 200 enstrümantasyonu (Luminex Corporation, Austin, TX, ABD) kullanılarak gerçekleştirilen ProcartaPlexTM Immunoassay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) ile ölçülmüştür. Ghrelin ve Pentraxin-3, sırasıyla Bio-Plex Pro-insan diyabeti ve Pro-insan inflamasyon tahlili (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) ile çok düzeyli olarak ölçülmüştür. Plakalar, Bio-Plex Manager Software (Bio-Rad) tarafından okunmuş ve analiz edilmiştir. Plazma homosistein, bir Olympus AU400 klinik kimya platformu (Beckman Coulter, High Wycombe, UK) kullanılarak enzimatik bir tahlille ölçülmüştür. Serum glukozu ve serum insülini sırasıyla biyokimyasal test ve kemilüminesans immünolojik test ile belirlenmiştir. İnsülin direnci durumu, aşağıdaki formül kullanılarak insülin direncinin (HOMA-IR) homeostaz modeli değerlendirmesine göre hesaplanmıştır: insülin (mIU/mL) x glikoz (mmol/L)/22.5.⁷⁰ Plazma albümini, bir VITROS 5.1/FS analiz cihazında VITROS ALB slaytları (Ortho-Clinical Diagnostics, UK) kullanılarak analiz edilmiştir. Plazma toplamı, Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein (HDL) ve Düşük Yoğunluklu Lipoprotein (LDL) kolesterol ve trigliseritler bir konelab sisteminde ölçülmüş ve reaktifler Thermo Scientific’ten (Asnières sur Seine, Fransa) alınmıştır. Kreatinin, ürik asit, alkalin fosfataz (ALP), gammaglutamil transpeptidaz (GGT), aspartat aminotransferaz (AST) ve alanin transaminaz (ALT) dahil olmak üzere diğer tüm biyokimyasal analizler, standart metodolojiler ile merkezi bir merkezde donmuş kan ve donmuş idrar (üre) üzerinde ölçülmüştür. 

Diyet alım verileri

Diyet alımı, başka bir yerde bildirildiği gibi 7 günlük gıda kayıtları ile değerlendirilmiştir.⁷¹ Kısaca katılımcılar yemek günlüğünü doğru bir şekilde doldurmaları için kapsamlı talimatlar alan görüşmeci tarafından bire bir eğitilmiştir. Gıda kayıtları, yiyeceklerin tüm detaylarını kaydetmek için her gün ve yemek yeme durumu, zaman/saat, yer, tüketilen yiyecek ve içecekler, miktar ve reçeteler için tablolarla yapılandırılmış bir formatta sağlanmıştır. Katılımcılara, gıdaların yenildiği/tüketildiği andaki verileri kaydetmeleri ve kayıt haftası boyunca yeme alışkanlıklarını değiştirmemeleri önerilmiştir. Kaydedilen sürenin sonunda gıda türleri, sosları, hazırlama yöntemleri ve tarifleri hakkında daha ayrıntılı bilgi edinmek, gerçek hayattaki modelleri ve resimleri kullanarak porsiyon boyutlarını tahmin etmek ve unutulmuş gıdaların olası tüketimini araştırmak için 7 günlük yemek kayıtları doğru bir şekilde kontrol edilmiştir. Tüketilen gıdalar standart prosedürlere göre kodlanmış ve yerel gıda kompozisyon tablolarından yararlanan WinFood® yazılımı kullanılarak besinlere çevrilmiştir: INRAN (Ulusal Gıda ve Beslenme Araştırmaları Enstitüsü, İtalya) ve IEO (Avrupa Onkoloji Enstitüsü, İtalya). Vücut ağırlığına göre standartlaştırılan enerji (kcal), toplam karbonhidrat (g), toplam protein (g), hayvansal ve bitkisel protein (g), toplam doymuş ve doymamış yağ (g), lif (g) kolesterol (g), su (g), vitamin (mg: biotin, B₁, B₂, B₃, B₆, C, E; μg: folik asit, β-karoten, A, B₁₂, D) ve kalsiyum (mg) alımı (g/kg BW) vücut ağırlığına göre normalleştirilen gıda gruplarının (beyaz ve tam tahıllar, meyve ve sebzeler, baklagiller, süt ürünleri, peynir, kırmızı ve işlenmiş et, beyaz et, kuruyemiş ve tohumlar, patates, yumurta ve yumurta ürünleri, tereyağı ve hayvansal yağlar, zeytinyağı, diğer bitkisel yağlar, şeker ve şekerli içecekler, şeker, bal ve yapay tatlandırıcılar, tatlı, çikolata ve atıştırmalıklar) (g/gün) alımı ile birlikte analizde kullanılmıştır. 7 günlük gıda kayıtlarından diyet alımları, belirli bir vitamin/mineral takviyesi anketi ile değerlendirildiği üzere ilgili diyet takviyelerinin alımlarına eklenmiş/toplanmıştır. 

Serum metabolomik analizi

Hedeflenmemiş metabolomikler, Pujos-Guillot vd.⁷²‘de açıklanan prosedür izlenerek gerçekleştirilmiştir. Kısaca, serum örnekleri (100 μL) soğuk metanol kullanılarak proteinlerinden arındırılmıştır. Azot altında buharlaştırmadan sonra kuru kalıntılar, %0.1 formik asit içeren 50/50 (v/v) asetonitril/su içinde yeniden çözündürülmüştür. Toplanmış kalite kontrol numuneleri, serum numunelerinin her birinden 20 μL karıştırılarak hazırlanmıştır. Metabolik profiller daha sonra, bir elektrosprey kaynağı ile donatılmış dört kutuplu uçuş süresi kütle spektrometresine (Bruker Impact HD2) bağlı ultra performanslı bir sıvı kromatografisi kullanılarak belirlenmiştir. Ayırmalar, bir Acquity HSS T3 kolonu (Waters) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veriler, 50 ile 1000 kütle-yük oranı (m/z) arasında bir tarama aralığı ile pozitif ve negatif iyon modlarında elde edilmiştir. Veriler, ilk XCMS kullanılarak Galaxy web tabanlı platform Worflow4metabolomics altında işlenmiş, ardından kalite kontrolleri ve sinyal kayması düzeltmesi yapılmıştır.⁷³ Kalan bilinmeyen bileşikler, İnsan Metabolom Veritabanında (HMDB) veya Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) veritabanında kayıtlı olanlarla karşılaştırılan kesin kütleleri baz alınarak tanımlanmıştır. Veritabanı sonuçları, uygun olduğunda izotop modelleri ve 100.000 çözme gücünde yüksek çözünürlük kullanılarak bir Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos hibrit kütle spektrometresinde (Thermo Fisher Scientific, San José, CA, ABD) gerçekleştirilen kütle fragmantasyon analizleri uygun standartlar kullanılarak doğrulanmıştır.

Mikrobiyal DNA ekstraksiyonu

Mikrobiyal DNA, tekrarlanan boncuk-dövme artı kolon yöntemi kullanılarak 250 mg fekal materyalden ekstrakte edilmiştir.⁷⁴ Kısaca, numuneler 1 mL lizis tamponu (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM EDTA ve %4 SDS) içinde süspanse edilmiş ve dört adet 3 mm cam boncuk ve 0.5 g 0.1 mm zirkonya boncuk (BioSpec Products, Bartlesville, OK, ABD) varlığında bir FastPrep cihazında (MP Biomedicals, Irvine, CA, ABD) 1 dk 5.5 hareket/s üç kez boncuk dövme işlemi yapılmıştır. Daha sonra örnekler 95°C’de 15 dakika inkübe edilmiş ve ardından 5 dakika 13,000 rpm’de santrifüjlenmiştir. Süpernatanta, 10 M amonyum asetattan 260 μL eklenmiş ve 5 dakika buz içinde inkübe edilmiştir. Bir başka santrifüjleme adımından sonra, süpernatana bir hacim izopropanol eklenmiş ve buz içinde 30 dakika inkübe edilmiştir. Çökelmiş DNA, %70 etanol ile yıkanmış ve 100 μL TE tamponu içinde yeniden süspanse edilmiştir. Örnekler sırasıyla RNA ve proteinlerden 2 μL 10 mg/mL DNase içermeyen RNase ile 37°C’de 15 dakika ve 15 μL proteinaz K (QIAGEN, Hilden, Almanya) 70°C’de 10 dakika süreyle tüketilmiştir. Nihai DNA saflaştırması, QIAamp DNA Stool Mini Kiti (QIAGEN) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Saflaştırılmış nükleik asitler, NanoDrop ND-1000 spektrofotometre (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, ABD) ile ölçülmüştür. 

16S rRNA gen amplifikasyonu ve dizileme

16S rRNA geninin V3–V4 hiperdeğişken bölgesi, daha önce bildirildiği gibi Illumina çıkıntı adaptör dizileriyle 341F ve 805R primerleri ile PCR amplifiye edilmiştir.⁷⁵ PCR termal döngüsü aşağıdaki gibidir: 95°C’de 3 dakika denatürasyon, ardından 95°C’de 30 saniye 25 döngü denatürasyon, 55°C’de 30 saniye yeniden birleştirme, ardından 72°C’de 30 saniye uzatma, ve son uzatma adımı 72°C’de 5 dakikadır. Agencourt AMPure XP manyetik boncukları (Beckman Coulter, Brea, CA, ABD) PCR amplikonlarını temizlemek için kullanılmıştır. İndeksli kütüphaneler Nextera teknolojisi kullanılarak sınırlı döngülü PCR ile elde edilmiştir. Yukarıda tarif edildiği gibi ikinci bir temizlemeden sonra, kütüphaneler eşmolar konsantrasyonda toplanmış, 0.2 N NaOH ile denatüre edilmiş ve 6 pM’ye seyreltilmiştir. Sıralama için, üreticinin talimatları izlenerek 2 x 250 bp eşleştirilmiş uç protokolü ile bir Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, CA, ABD) platformu kullanılmıştır. Sıralama verileri NCBI SRA’da BioProject ID: PRJNA661289 altında mevcuttur.

Biyoinformatik ve Biyoistatistik

Dizileme okuma kalitesi Fastqc aracıyla değerlendirilmiştir. Yüksek kaliteli okuma çiftleri, PANDAseq aracıyla tek bir okumada birleştirilmiştir ve uzunluğu 350 bp’den düşük ve 500 bp’den büyük olan sonuçtaki okumalar filtrelenmiştir. Ayrıca tek uçlu okumalar, veri kümesinin anlamsız verilerini azaltmak, kimera dizilerini ve kopyaları ortadan kaldırmak ve onları amplikon dizi varyantları (ASV’ler) halinde kümelemek için DADA2 ile önceden işlenmiştir.^76,77 VSEARCH algoritması, SILVA veri tabanından (128 versiyonu) önceden hesaplanmış kümelere karşı temsili özellik dizilerini %99 dizi özdeşliğinde taramak ve taksonomiyi >0.5 güven puanı ile belirlemek için uygulanmıştır.⁷⁸ ASV’ler tablosu, bir numunedeki minimum özellik dizisi sayısıyla normalleştirilmiştir. QIIME 2 (sürüm 2018) çerçevesinde okuma ön işleme ve taksonomik sınıflandırma gerçekleştirilmiştir.⁷⁹ İstatistiksel analiz için R paketleri Phyloseq ve Vegan kullanılmıştır. Beta çeşitliliği; ağırlıksız, ağırlıklı ve genelleştirilmiş UniFrac metrikleri (GUniFrac paketi) ile hesaplanmış ve adonis işlevi, Temel Koordinatlar Analizinde (PCoA) beta çeşitliliğine dayalı örnek ayrımının önemini test etmek için kullanılmıştır.^80,81 Ağırlıksız UniFrac tabanlı PCoA’da bulunan üç mikrobiyom grubunun (G1’den G3’e) ayrılması, bağlantı yöntemi olarak Ward ile hiyerarşik kümeleme yoluyla doğrulanmıştır. PCoA grupları ve hiyerarşik kümeleme ayrımı arasındaki eşleşim, Fisher’in kesin testi ile doğrulanmıştır. Kümelerin kararlılığı, R paketi fpc’deki clusterboot işlevinden alınan ortalama Jaccard benzerlikleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Alfa çeşitliliği, gözlemlenen ASV’lerin sayısı ve Chao1 indeksi kullanılarak tahmin edilmiştir. Güç hesaplaması micropower R paketi⁸² ile hesaplanmıştır; G1’den G3’e mikrobiyom gruplarının boyutunun %90 gücün 0.014’lük bir ω2 algılamasına izin verdiğini bulduk. 

Bağırsak mikrobiyota profilleri ile konakçı özellikleri arasındaki ilişkileri bulmak için, R’deki mixOmics paketinde uygulandığı gibi seyrek kısmi en küçük kare (sPLS) regresyon analizini benimsedik ve çoklu regresyon yoluyla DXA ölçümlerine veya metabolit sınıflarına göre cins düzeyi nispi bollukları modelledik.⁸³ Bileşenlerin sayısı, modeldeki tüm DXA/metabolomik değişkenleri ve tüm taksonları tutarak, perf işlevle 2’ye ayarlanmıştır. Bakteriyel bolluklar, ortalanmış log oranı (CLR) olarak dönüştürülmüştür. Cinsler ve DXA/metabolomik matrisler arasındaki ilişkiler, değişkenler aynı yönde yansıtılan ilişkili değişkenlerle birlikte bir korelasyon daire grafiği (plotVar) içinde yansıtılarak görselleştirilmiştir.⁸⁴ sPLS regresyon modelinde hiyerarşik kümeleme (cim), mesafe ve tam bağlantı yöntemi olarak Pearson korelasyonu ile çizilmiştir. Diyete gelince, PCoA sınıflandırma alanına en çok katkıda bulunan gıda grupları veganın “envfit” işlevi kullanılarak belirlenmiştir. Takson nispi bolluğunda ve ayrıca DXA ile ilgili değişkenlerin ölçümlerinde, diyet ve metabolomik verilerde ve sağlıkla ilgili diğer parametrelerde PCoA tarafından tanımlanan mikrobiyota grupları arasındaki önemli farklılıklar Kruskal-Wallis testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Wilcoxon testi, her bir grup çifti arasındaki farklılıkları kontrol etmek için posthoc testi olarak benimsenmiştir ve Benjamini-Hochberg yöntemi ile çoklu testler için p değerleri ayarlanmıştır. Bir p değeri ≤ 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.