Akkermansia muciniphila, bağırsak-böbrek ekseni yoluyla kronik böbrek hastalığı interstisyel fibrozisini iyileştirir

ÖZET

İçerik: Kronik böbrek hastalığı (KBH), küresel nüfusun yaklaşık %10’unu etkiler. Akkermansia muciniphila’nın (AKK) bolluğu, KBH hastalarında önemli ölçüde azalmaktadır.

Amaç: Bu çalışmada, AKK bakterilerinin KBH’li sıçanlarda böbrek hasarı ve renal interstisyum  üzerindeki etkileri araştırılmıştır.

Materyal ve Metotlar: KBH model 5/6 nefrektomi sıçanları kullanılmıştır. KBH sıçanlarına 8 hafta boyunca AKK (2 x 10⁸ cfu/0.2 mL) takviye verilmiştir. 

Bulgular: AKK uygulaması, epitelyal-mezenkimal geçişi (EMT) önemli ölçüde baskılamıştır ve yüksek çıktılı 16S rRNA pirosekanslama, AKK takviyesinin KBH sıçanlarında düzensiz bağırsak mikroekolojisini düzelttiğini göstermiştir. AKK ayrıca bağırsak mukozal bariyer fonksiyonunu da iyileştirmiştir. AKK, bağırsak mikroekolojisini düzenleyebilir ve probiyotik bolluğunu artırarak ve bağırsak mukozal bariyerindeki hasarı azaltarak renal interstisyel fibrozu azaltabilir.  

Sonuç: Bulgular, AKK uygulamasının renal fibrozis ve KBH tedavisi için yeni bir terapötik strateji olabileceğini düşündürmektedir.

1. Giriş

Kronik böbrek hastalığı (KBH), önemli bir halk sağlığı sorunudur [1]. Küresel olarak 2017 yılında 12 milyon kişi KBH nedeniyle ölmüştür ve hastalığın yaygınlık oranı %9,1’idi [2]. 3’üncü evre  KBH’a sahip bireyler arasında nihayetinde hastaların %11’inde son evre böbrek hastalığı (SEBH) gelişir ve diyalize ihtiyaç duyulur [3]. Ayrıca, SEBH tedavisi daha büyük sosyoekonomik yüke neden olmaktadır. Ayrıca KBH kardiyovasküler hastalıklar için en güçlü risk faktörlerinden biridir [4]. Ancak, KBH’nin ilerlemesini yavaşlatmak ve KBH ile ilişkili komplikasyonları önlemek için mevcut tedaviler sınırlıdır [5]; bu nedenle, KBH’yi tedavi etmek ve ilişkili tıbbi maliyetleri azaltmak için daha etkili tedavilere ihtiyaç vardır.

Önceki bir çalışmada [6], KBH’lı hastalarda bağırsak mikrobiyotasının bolluğu ve bileşiminin önemli ölçüde azaldığı gösterilmiştir. Actinomycetes ve Akkermansia’nın bolluğu azalmış, ancak Verrucomicrobia ve Lactobacillus, Clostridium, Paraprevotella, Clostridium sensu stricto, Desulfovibrio ve Heteroprevotella’nın bolluğu artmıştır. KBH’lı hastalarda önemli probiyotik AKK bolluğunun azalması, plazma interlökin 10 (IL-10) seviyeleri ile negatif korelasyon göstermektedir; bu, KBH’de mikrobiyotadaki değişikliklerin kronik sistemik inflamasyonu destekleyebileceğini göstermektedir.

AKK oval şekilli, zorunlu anaerobik, hareketsiz ve endospor oluşturmayan gram negatif bir bakteridir [7] ve “yeni nesil probiyotik” olarak kabul edilir [8]. AKK, mukozal tabakada yaşayan ve konakçı metabolik bozuklukların ve bağışıklık tepkilerinin iyileştirilmesinde önemli bir rol oynayan bağırsak simbiyotik bir bakteridir [9]. Ayrıca AKK ile endotoksinlerin birikmesi ve bağırsak mukozal bariyerinin restorasyonu arasındaki ilişki önemli merak kaynağıdır [10].

Kısaltmalar
KBH	Kronik Böbrek Hastalığı
SEBH	Son Evre Böbrek Hastalığı
IL-10	İnterlökin 10
AKK	Akkermansia muciniphila
RIF	Renal interstisyel fibrozis
EMT	Epitelyal-Mezenkimal Geçiş
α-SMA	α- Düz kas aktin
IACUC	Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi
LPS	Lipopolisakkarit
OTUs	Operasyonel taksonomik birimler
H&E	Hematoksilen ve eozin
PAS	Periyodik asit-Schiff
IF	İmmünofloresan
Scr	Serum kreatinin
BUN	Kan üre azotu
NCBI	Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi
PcoA	Ana koordinat analizi
NF-κB	Nükleer faktör-κB

Renal interstisyel fibrozis (RIF), neredeyse tüm kronik ve ilerleyici böbrek hastalıklarının son noktasıdır [11] ve böbrek fonksiyonundaki düşüşün en iyi histolojik belirleyicisidir [12]. Fibrozis, doku onarım yeteneğini azaltır ve sonunda böbrek yetmezliğine yol açar [13]. RIF’nin histopatolojik özellikleri, hücre dışı matris (ECM) bileşenlerinin birikmesi [14] ve mezenkimal fenotip ve miyofibroblast fonksiyonuna sahip renal tübüler epitel hücreleri ile karakterize edilen epitelyal-mezenkimal geçiştir (EMT) [15]. EMT, adezyon konneksinlerini (E-cadherin gibi) azaltmak için renal epitel hücrelerini uyarır ve vimentin ve α-düz kas aktini (α-SMA) [16] gibi fibroblast belirteçlerinin ekspresyonunu güçlü bir şekilde indükler. 

KBH, bağırsak bariyer fonksiyonunu bozabilmekte ve tüm gastrointestinal sistemin iltihaplanmasını teşvik edebilmektedir [17]. Üremik sıçanlarda kolon-kolon epitel bileşke rüptürü kanıtı ve diyalize devam eden SEBH’ye sahip hastalarda kronik enterokolitin histolojik kanıtı, endotoksin birikiminin tüm vücut iltihabını ve oksidatif stresi indükleyebileceğini göstermektedir [17]. KBH ve onun tedavisi, bağırsağın biyokimyasal ortamını önemli ölçüde değiştirebilmekte [18] ve böylece mikrobiyal floranın yapısını, bileşimini ve işlevini değiştirebilmektedir.

Normal koşullar altında KBH, yaygın simbiyotik ilişkilere müdahale edebilmekte ve normal flora tarafından sağlanan yararlı işlevleri ve ürünleri sınırlarken proinflamatuar ve diğer zararlı yan ürünlerin üretimine ve emilimine yol açabilmektedir [19]. Çalışmalar, AKK’nın bağırsak mikroekolojisinin restorasyonunu düzenleyebildiğini [20] ve floranın simbiyozu yoluyla bağırsak mukozal bariyerini restore edebildiğini [21], böylece bağırsak ve toplam inflamasyonu [9] ve toksin birikimini [22] azalttığını göstermiştir.

Bununla birlikte, AKK uygulamasının KBH’de bağırsak mikroekolojisi ve interstisyel fibroz üzerindeki etkisi henüz açıklığa kavuşturulmamıştır. Bu çalışmada, AKK’nın KBH üzerindeki etkisini incelemek için 5/6 nefrektomize sıçanlarına AKK uygulaması yapılmıştır. Ayrıca, KBH’li sıçanlarda bağırsaklar ve böbrekler yoluyla AKK’nın renal interstisyel fibrozu hafiflettiği mekanizma ve durumdaki iyileşme değerlendirilmiştir. 

2. Materyal ve Metotlar

2.1. Hayvanlar ve deneysel tasarım

Tüm hayvan prosedürleri, Güney Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (sertifika numarası SCXK (Yue) 2016-0041 ve kullanım lisans numarası SYXK (Yue) 2016-0167). 6-7 haftalık (200-250 g) erkek Sprague-Dawley sıçanları, Guangzhou, Çin, Güney Tıp Üniversitesi Deneysel Hayvan Merkezinden satın alınmıştır. Onlar 22–23 ◦C’de, 12 saat aydınlık/12 saat karanlık döngüsünde, suya serbest erişimi olan kafeslerde tutulmuşlardır. Sıçanların genel görünümleri ve duygusal durumları izlenmiştir. Sıçanlar rastgele sham operasyon (n=4) ve 5/6 nefrektomi (5/6 Nx, n=10) gruplarına ayrılmıştır. Sham operasyonu, sham-operated sıçanlara yapılırken, 5/6 Nx grubundaki (aynı zamanda KBH grubu olarak da anılır) sıçanlara sol böbreğin üst ve alt üçte birlik kısmının cerrahi rezeksiyonu ve 1 hafta sonra sağ nefrektomi uygulanmıştır. Ameliyattan sonra hayvanlar; yürüyebilene, beslenebilene ve su içebilene kadar ev kafeslerine yerleştirilmiştir. Ameliyattan sekiz hafta sonra, sıçanlara oral gavaj ile birbirini izleyen 7 gün boyunca günde bir kez ampisilin, gentamisin, metronidazol, neomisin (hepsi 0.25 mg/gün) ve vankomisin (0.125 mg/gün) kokteyli verilmiştir [23]. Kombine antibiyotiklerin kesilmesinden bir hafta sonra 5/6 Nx sıçanları ayrıca rastgele iki gruba ayrılmıştır: midenin salin irrigasyonu ile tedavi edilen 5/6 Nx model grubu (n = 4) ve AKK ile tedavi edilen grup (n = 5). AKK intragastrik olarak 2 x 10⁸ CFU/0.2 mL dozunda uygulanmıştır, aseptik ve anaerobik fosfat tamponlu salin (PBS) içinde süspanse edilmiş ve pastörize edilmiştir. Kontrol grubu, benzer bir nihai gliserol konsantrasyonu (%2.5 v/v) içeren aynı miktarda aseptik ve anaerobik PBS ile tedavi edilmiştir. Sıçanlar ilk hafta boyunca günlük olarak ve daha sonra ötenazi yapılana kadar 2 günde bir izlenmiştir. Bu izlemeye dayanarak, sıçanların genel görünümü değerlendirilmiştir. İzleme kriterleri şunları içeriyordu: (a) vücut duruşu ve hareketi ile izlenen ağrı; (b) çatlama ve şişme ile değerlendirilen yara iltihabı; (c) yara kanaması; (d) anormal yürüyüş, hemipleji veya koma ile teşhis edilen mental durum; ve (e) vücut ağırlığı.

2.2. Bakteri

AKK (GDMCC 1.1346, Guangzhou, Çin), zorunlu anaerobik koşullar altında 37 ◦C’de ve pH 6.5’te %0.25 w/v müsin içeren bir bazal ortamda kültürlenmiştir. Pastörizasyon, daha önce tarif edildiği gibi üretilen canlı A. muciniphila’nın 30 dakika boyunca 70°C’de ısıl işleminden oluşuyordu. Kanlı agarın temel hazırlama yöntemi aşağıdakileri içermektedir: tartım formülü: birim g/L; pepton: 10.0 gr; sığır ekstraktı: 3.0 g; sodyum klorür: 5.0 g; ağar ağar: 15.0 g; pH 7,3 ± 0,1 (25 ◦C). Toplam 33.0 g içerik 1 L distile veya kaynatılarak deiyonize suda tamamen çözülmüş, paketlere bölünmüş, 121 ◦C’de 15 dakika otoklavda sterilize edilmiştir, sterilizasyondan sonra agarın kabın dibinde birikmesini önlemek için iyice çalkalanmış ve 50 ◦C’ye soğutulmuştur. Ardından %5-10 defibrile edilmiş koyun kanı ilave edilerek solüsyon iyice karıştırıldıktan sonra petri kutularına dökülmüştür. 

2.3. Kan ve idrar tahlili

Çalışmanın sonunda, sıçanlara sodyum pentobarbital (40 mg/kg) intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi uygulanmış ve bir sıçan ameliyat masasına sabitlenmiştir. Rutin dezenfeksiyon sonrası karın boşluğu orta hattan makasla kesilmiştir. Cerrah, ponksiyon iğnesini sağ tarafında tutmuş, iğne ucu abdominal aortaya doğru aşağı eğimli, iğne açısı yaklaşık 25–30◦ ve derinliği yaklaşık 5 mm idi. Toplam 10 ml kan vakumlu tüplerde toplanmıştır. Serum toplanması için kan 3,000 rpm’de 15 dakika santrifüjlenmiştir. Anestezi uygulanmış sıçanlardan alınan aort kanında; serum kreatinin (SCr; C011-2-1JianChen Nanjing), kan üre azotu (BUN; C013-1-1JianChen Nanjing), serum albümini (ALB; A028-2-1JianChen Nanjing), IL-1 (JM-10482R1), IL -6 (HQ-30646) ve lipopolisakarit (LPS) (HQ-30079) ölçülmüştür. 

24 saatlik idrar numuneleri, metabolik kafesler kullanılarak toplanmış ve idrar protein atılımı, üreticinin talimatlarına göre ticari bir kit (C035-2-1, JianChen Nanjing) kullanılarak test edilmiştir. 

2.4. 16S rRNA dizilimi

2.4.1. DNA ekstraksiyonu ve PCR amplifikasyonu

Dışkı örnekleri standart toplama prosedürleri kullanılarak toplanmış ve rastgele seçilmiştir. Mikrobiyal topluluk genomik DNA’sı, üreticinin talimatlarına göre E.Z.N.A.® toprak DNA Kiti (Omega Bio-tek, Norcross, GA, ABD) kullanılarak sıçan numunelerinden ekstrakte edilmiştir. DNA ekstraktı, %1 agaroz jel üzerinde analiz edilmiş ve DNA konsantrasyonu ve saflığı, bir NanoDrop 2000 UV-vis spektrofotometre (Thermo Scientific, Wilmington, NC, ABD) kullanılarak tespit edilmiştir. Bakteriyel 16S rRNA geninin hiperdeğişken bölgesi V3–V4, ABI GeneAmp® 9700 PCR termocycler (ABI, CA, U S) kullanılarak 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) ve 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) primer çiftleri ile amplifiye edilmiştir. 16S rRNA geninin PCR amplifikasyonu  şu şekilde gerçekleştirilmiştir: 95 ◦C’de 3 dakika süreyle ilk denatürasyon, ardından 95 ◦C’de 30 saniye boyunca 27 döngü denatürasyon, 55 ◦C’de 30 s bağlanma ve 72 ◦C’de 45 s uzama, 72 ◦C’de 10 dakika boyunca tek bir uzama ve 4 ◦C’de bitiş. PCR karışımları; 5 × TransStart FastPfu tampon 4 μL, 2.5 mM dNTPs 2 μL, ileri primer (5 μM) 0.8 μL, ters primer (5 μM) 0.8 μL, TransStart FastPfu DNA Polimeraz 0.4 μL, kalıp DNA 10 ng ve 20 μL ddH₂O içermektedir. PCR üç kopya halinde gerçekleştirilmiştir. PCR ürünleri, %2’lik bir agaroz jelinden ekstrakte edilmiştir, üreticinin talimatlarına göre AxyPrep DNA Jel Ekstraksiyon Kiti (Axygen Biosciences, Union City, CA, ABD) kullanılarak saflaştırılmıştır ve bir Quantus Fluorometer (Promega, Madison, WI, ABD) kullanılarak ölçülmüştür. Illumina MiSeq dizilim saflaştırılmış amplikonlar, eşmolar miktarlarda havuzlanmıştır ve eşleştirilmiş uç Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd. (Shanghai, Çin) tarafından tanımlanan standart protokollere göre bir Illumina MiSeq PE300 platformu/NovaSeq PE250 platformunda (Illumina, San Diego, CA, ABD) sıralanmıştır. Ham okumalar, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) Dizi Okuma Arşivi veritabanında depolanmıştır. 

2.5. Dizileme verilerinin işlenmesi

Ham 16S rRNA gen dizilimi okumalarının çoğullamaları çözülmüş, fastp sürüm 0.20.0 kullanılarak kalite filtresi uygulanmıştır [24] ve FLASH sürüm 1.2.7 [25] kullanılarak aşağıdaki kriterlerle birleştirilmiştir: (i) 50 bp’lik bir kayan pencere üzerinde ortalama <20 kalite puanı alan herhangi bir sitede kesilen 300 bp okumalar, 50 bp’den daha kısa kesilmiş okumalar ve belirsiz karakterler içeren okumalar atılmıştır. (ii) Yalnızca 10 bp’den daha uzun örtüşen dizilimler, onların örtüşen dizilimlerine göre bir araya getirilmiştir. Örtüşen bölgedeki maksimum uyuşmazlık oranı 0.2 idi. Bir araya getirilemeyen okumalar atılmıştır. (iii) Numuneler barkod ve primerlere göre ayırt edilmiş ve dizileme yönü, tam barkod eşleşmesi ve primer eşleşmesinde iki nükleotid uyumsuzluğu ile ayarlanmıştır.  

%97 benzerlik kesimine [26] sahip operasyonel taksonomik birimler (OTU’lar), UPARSE sürüm 7.1 [26] kullanılarak kümelenmiş ve kimerik dizilimler tanımlanmış ve kaldırılmıştır. Her OTU temsili diziliminin taksonomisi, 0.7’lik bir güven eşiği kullanılarak 16S rRNA veri tabanına (Silva v138) karşı RDP Sınıflandırıcı sürüm 2.2 [27] kullanılarak analiz edilmiştir.

2.6. Histolojik Analiz

Böbrek ve bağırsak dokuları, anestezi uygulanmış sıçanlardan dikkatlice ayrılmış ve gece boyunca 4 °C’de %4 paraformaldehite daldırılmıştır. Dokular parafine gömüldükten sonra ince dilimler halinde (4 μm) kesilmiştir. Böbrek ve bağırsak dokuları hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyanmıştır. Affity’nin standart IHC parafin protokolü izlenerek, böbrek kesitleri periyodik asit-Schiff (PAS) ve Mallory ile boyanmıştır. İmmünofloresan (IF) analizi için, böbrek kesitleri %5 BSA ile 1 saat süreyle bloke edilmiş ve α-SMA, vimentin, E-cadherin primer antikoru (1:200; Affity) ile 4 ◦C’de gece boyunca inkübe edilmiş ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca Cy3 etiketli sekonder antikor ile inkübe edilmiştir. Çekirdekler DAPI (Servicebio) ile boyanmıştır. Görüntüler bir MVX20 mikroskobu (Olympus) kullanılarak alınmıştır. IF görüntüleme için bir konfokal mikroskop (Zeiss, LSM800) kullanılmış ve görüntü işleme için ZEN yazılımı ve Microsoft PowerPoint kullanılmıştır. 

2.7. Polimeraz zincir reaksiyonu

Toplam RNA, TRIzol reaktifi (Vazyme Biotech Co., Ltd.) kullanılarak böbrek dokularından ekstrakte edilmiş ve qPCR (+gDNA silici) kiti (Vazyme Biotech Co., Ltd.) için HiScript® III RT SuperMix kullanılarak cDNA’ya dönüştürülmüştür. qPCR, ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme Biotech Co., Ltd.) kullanılarak yapılmıştır. Nisbi gen ekspresyonu, kat değiştirme (2-ΔΔCT) yöntemi kullanılarak analiz edilmiştir. 

2.8. Western blot 

Proteinler, üreticinin talimatlarına göre bir tam hücre lizis tahlili (KeyGEN, Nanjing, Çin) kullanılarak ekstrakte edilmiştir. Proteinler, SDS-PAGE kullanılarak ayrılmış ve PVDF membranlarına (Millipore, Bedford, MA, ABD) aktarılmıştır.  Membranlar %5 BSA içinde 1.5 saat süreyle bloke edilmiş ve daha sonra belirtilen birincil antikorlarla inkübe edilmiştir: claudin-2 (AF0127; 1:1000; Affinity, Jiangsu, Çin), ZO-1 (AF5145; 1:1,000; Affinity), α-SMA (BF9212; 1:1000; Affinity) ), Vimentin (AF7013; 1:1,000; Afinite), E-cadherin (AF0131; 1:1,000; Afinite) ve GAPDH–HRP (D16H11, 1:1000; CST). TBS-T ile yıkandıktan sonra membranlar, GAPDH-HRP antikorunun kullanıldığı durumlar dışında, ikincil antikorlarla (SA00001-2, 1:8,000; Proteintech) 2 saat 4 °C’de inkübe edilmiştir. Protein sinyalleri, bir ECL sistemi (Affinity) kullanılarak tespit edilmiştir. 

2.9. İstatistiksel analizler

İstatistiksel analizler SPSS yazılımı (IBM SPSS Statistics for Windows, sürüm 20; IBM Corp., Armonk, NY, U S) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Gruplar arası karşılaştırmalar, bir bağımsız değişkenli gruplar için tek yönlü ANOVA ve iki bağımsız değişkenli gruplar için iki yönlü ANOVA kullanılarak gerçekleştrilmiştir ve ardından en az anlamlı fark post hoc testi yapılmıştır. Bağımsız gruplar arasındaki karşılaştırmalar için aşağıdaki anlamlılık seviyeleri kullanılmıştır: kontrol grubuna karşı *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001; model grubuna karşı ^#p < 0,05, ^##p < 0,01 ve ^###p < 0,001. “ns” anlamlı bir fark bulunmadığını göstermektedir.

3. Sonuçlar

3.1. AKK böbrek fonksiyonunu iyileştirmiş ve kronik renal interstisyel fibrozisini inhibe etmiştir

Scr, BUN, ALB ve 24 saatlik idrar protein seviyeleri böbrek fonksiyonunun klasik göstergeleridir. Şekil 1’de; sham, 5/6 Nx ve AKK ile tedavi edilen gruplarda böbrek fonksiyonu ve vücut ağırlığı gösterilmektedir.

E tablosunun altındaki yazının çevirisi: *P<0.05, sham operasyon grubuyla karşılaştırıldığında ^#P<0.05, model grubuyla karşılaştırıldığında.

Şekil 1. AKK, 5/6 nefrektomi sıçanları tarafından böbrek fonksiyon parametrelerini ve böbreğin vücut ağırlığını azaltır (A) AKK, KBH sıçanlarının 24 saatlik idrar protein seviyesini azaltabilmektedir. (B) AKK, KBH sıçanlarının serum kreatininini (Scr) azaltabilmektedir (n = 5). (C) AKK, KBH sıçanlarının kan üre azotu (BUN) serum seviyesini azaltabilmektedir (n = 5). (D) AKK, KBH sıçanlarının serum albümin (ALB) seviyesini iyileştirmemiştir. (E) AKK, KBH Sıçan vücut ağırlığını artırabilmektedir. Tüm veriler ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir. 5/6NX grubuna karşı ^#P < 0.05, ^##P < 0.01, sham grubuna karşı *P < 0.05, **P < 0.01.   

BUN, SCr ve 24 saatlik idrar protein seviyeleri sham grubunda normal sınırlar içindeydi ancak 5/6NX grubunda artmıştır. Bununla birlikte, 8 haftalık AKK uygulamasından sonra, AKK ile tedavi edilen grupta BUN, SCr ve 24 saatlik idrar protein seviyelerinde önemli düşüşler gözlemlenmiş (Şekil 1A-C), ancak AKK, serum ALB seviyelerini iyileştirmemiştir (Şekil 1D). Vücut ağırlığı doğrudan bir gösterge olarak ölçülmüştür. Vücut ağırlığı, 5/6 Nx model grubunda sham grubuna göre önemli ölçüde düşüktü, oysa AKK ile tedavi edilen grupta artmıştır (Şekil 1E). 

H&E, Mallory ve PAS boyaması, 5/6 Nx model grubunda böbrek yapısal hasarı, inflamatuar hücre infiltrasyonu ve hücre dışı matris birikimini ortaya çıkarmıştır; bunlar, AKK tedavisi ile önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 2A-C). Ayrıca Mallory boyaması, 5/6 Nx sıçanlarında birçok mavi-boyalı kollajen fiber izi ve belirgin kollajen fiber hipertrofisi göstermiştir. Bununla birlikte, sıçanlar AKK ile tedavi edildiğinde daha az kollajen fiber izleri gözlenmiştir (Şekil 2D). PAS boyaması, sham operasyon grubundaki sıçanların glomerüllerinin sağlam ve temiz olduğunu ve renal tübüllerin yapısının sağlam ve düzenli olduğunu göstermiştir. Sham operasyon grubu ile karşılaştırıldığında, 5/6 Nx model grubundaki sıçanların glomerüler bazal membranı biraz büyümüş ve mezengial hücreler ve mezengial matrix çoğalmıştır. 5/6 Nx model grubuyla karşılaştırıldığında, AKK tedavi grubundaki sıçanların glomerüler bazal membran kalınlaşması iyileşmiş ve mezengiyal hücrelerin ve mezengial matrixin çoğalması azalmıştır (Şekil 2E). Bu sonuçlar, AKK’nin 5/6 Nx sıçanlarda böbrek hasarını ve fibrozisi iyileştirdiğini göstermektedir. 

Şekil 2. AKK, 5/6 nefrektomi sıçanlarda renal fibrozisin histopatolojisini iyileştirmiştir. (A) Sıçan böbreğinin mallory boyaması (ölçek çubuğu = 100 μm). (B) Sıçan böbreğinin PAS boyaması (ölçek çubuğu = 100 μm). (C) Sıçan böbreğinin HE boyaması (ölçek çubuğu = 100 μm). (D) Mallory boyaması kollajen içerik analizi sonuçlarının histogramı. (E) PAS boyaması kollajen içerik analiz sonuçlarının histogramı. Kontrol grubuna karşı ****p < 0.0001 ve Model grubuna karşı ^####p < 0.0001.

3.2. 5/6 Nx sıçanlarda bağırsak mikrobiyotası üzerinde AKK’nın etkisi

Dışkı örneklerinde 16S rRNA geninin değişken bölgesinin (V3/V4) dizisi analiz edilmiştir. Dışkı metagenomik dizilim verileri, erişim kodlarıyla birlikte NCBI veri tabanında mevcuttur. Topluluğun zenginliğini ve çeşitliliğini belirlemek için Chao, Shannon, Simpson, Sobs ve Shannon çeşitlilik indeksleri ölçülmüştür. Sham operasyon grubuyla karşılaştırıldığında, 5/6 Nx model grubundaki floranın bolluğu ve çeşitliliği azalmıştır, AKK müdahalesinden sonra artmıştır (Şekil 3A ve B). Temel koordinat analizi (PCoA); sham operasyonun, 5/6 Nx modelinin ve AKK ile tedavi edilmiş grupların daha iyi kümelemeye sahip olduğunu ortaya çıkarmıştır. Model grubuyla karşılaştırıldığında, AKK ile tedavi edilen grup kontrol grubuna yaklaşmaya başlamıştır (Şekil 3C). Bar plot, Circos (Ek 1) ve ısı haritası (Şekil 3D) analizleri de yapılmıştır. Cins düzeyinde, Lachnospiraceae (sham, 5/6 Nx modeli ve AKK = sırasıyla %10, %80 ve %74), Muribaculaceae (sırasıyla %17, %22 ve %18) ve Blautia ( sırasıyla %2, %9 ve %6) ‘da bir artış ve Prevotella (sırasıyla %7, %5 ve %10) ve Collinsella (sırasıyla %7, %1 ve %1) ‘da bir azalma vardı. AKK ekspresyonu seviyelerindeki farklılıklar analiz edilmiştir (Ek 2). 8 haftalık AKK müdahalesinden sonra, 5/6 Nx sıçanlarında AKK kolonizasyonu önemli ölçüde artmıştır. Bir Circos haritası histogram analizinin sonuçlarıyla tutarlı olan örnekler ve bakteri topluluğu arasındaki bolluk ilişkisini cins düzeyinde görselleştirmek için kullanılmıştır. 

Şekil 3. 5/6 nefrektomi sıçanlarının bağırsak mikroekolojisi üzerinde AKK’ın etkisi ((A) Her gruptaki Sobs indeksinin ifadesi (B) Her gruptaki npshannon indeksinin ifadesi (C) İşletme taksonunda PCoAplot (OTU)) düzeyinde Bray-Curtis mesafesi. (D) Cins düzeyinde topluluğun nisbi bolluğunun Barplot analizi. Bolluğu 0.01’den (%1) az olan cinsler “diğer” kategorisine eklenir. (D) Mikrobiyal topluluk bolluğu dağılım haritasının filum düzeyinde ısı haritası. Toplam bolluktaki ilk 50 tür.

3. AKK’nın bağırsak bariyeri üzerindeki etkisi

Histolojik ve Western blot analizleri, 5/6 Nx sıçanlarında bağırsakların bütünlüğünün ve sıkı bağlantısının bozulduğunu göstermiştir. H&E ile boyanmış bağırsaklar, 5/6 Nx model grubunda düzensiz bir hücre dizilimi göstermiş ve villuslarda ödem gözlemlenmiştir (villus genişliği artmıştır). 5/6 Nx model grubuyla karşılaştırıldığında, sham operasyon ve AKK ile tedavi edilen grupların bağırsak mukozası; kriptlerde daha az inflamatuar infiltrasyon, azalmış villus (Şekil 4A) ile daha eksiksiz bir yapı ve AKK ile tedavi edilen grupta daha yüksek ZO-1 protein seviyeleri (Şekil 4B ve C) göstermiştir. Ayrıca AKK ile tedavi edilen grupta claudin-2 protein ifadesi azalmıştır. 

Şekil 4. 5/6Nx sıçanda AKK’nın bağırsak bariyeri üzerindeki etkisi. (A) Sıçan bağırsak dokularının HE boyaması (ölçek çubuğu = 100 μm). (B) Bağırsakta ZO-1 ve caludin-2’nin Western blot analizi. (C) Western boyama ile protein ölçümü. Tüm veriler, ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir (her grup için n = 5), Kontrol grubuna karşı *p < 0.05, **p < 0.01 ve model grubuna karşı ^#p < 0.05, ^##p < 0.01.

3.4. AKK’nın inflamatuar faktörler ve endotoksik toksinler üzerindeki etkisi ve inflamatuar faktörler ile bağırsak mikrobiyotası arasındaki korelasyon

Sıçanlarda inflamatuar değişiklikleri araştırmak için her grupta IL-1β, IL-10 ve LPS inflamatuar faktörlerinin seviyeleri ölçülmüştür. Tüm faktörler, 5/6 Nx model grubunun serumunda belirgin bir şekilde artmış, bu da inflamasyonun renal fibrozis gelişiminde hayati bir rol oynadığını göstermektedir. Ayrıca AKK, 5/6 Nx sıçanlarının (Şekil 5A, B ve C) serumundaki IL-1β, IL-10 ve LPS seviyelerini önemli ölçüde düşürmüş, bu da AKK’nın KBH’de inflamatuar yanıtı önleyebileceğini göstermektedir.  

Cins düzeyinde bağırsak mikroekolojisi ve IL-1β, IL-6 ve LPS’nin korelasyon analizinde; Parasutterella, Lactobacillus ve Lachnospiraceae IL-1, IL-6 ve LPS ile pozitif korelasyon gösterirken; Eubacterium ve Ruminococcaceae IL-1, IL-6 ve LPS ile negatif korelasyon göstermiştir (Şekil 5D). OTU seviyesindeki db-RDA analizinde 5/6 Nx sıçanları; IL-1, IL-6 ve LPS ile pozitif bir korelasyon göstermiştir.  Sham operasyon ve AKK ile tedavi edilen gruplar; IL-1, IL-6 ve LPS seviyeleri ile negatif bir korelasyon göstermiştir (Şekil 5E).

Şekil 5. AKK’nın 5/6Nx sıçanlarda inflamasyon ve endotoksin üzerindeki etkisi ve inflamatuvar faktörlerin, endotoksik toksinlerin ve bağırsak florasının korelasyon analizi. (A) IL-1β, (B) IL-6, (C) LPS (D) IL-1β, IL-6 ve LPS’nin bağırsak florası ile korelasyon analizi. (E) IL-1β, IL-6 ve LPS’nin her grupla korelasyon analizi. Çubuklar, her grubun ortalama ± SE’sini temsil etmektedir (n = 5). Kontrol grubuna karşı *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001 ve model grubuna karşı ^#p < 0.05, ^##p < 0.01 ve ^###p < 0.001.

3.5. AKK, KBH sıçanlarında EMT’yi inhibe etmiştir

AKK’nın ECM ve fibrozis işaretleri seviyelerini etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için, böbrek dokusunun q-PCR, western blotting ve immünofloresan kimyasal analizleri gerçekleştirilmiştir. EMT aktivasyonu, miyofibroblast üretimi ile ilişkilidir. Bu çalışmada AKK, 5/6 Nx sıçanlarında α-SMA ve vimentin seviyelerini aşağı regüle etmiş ve E-cadherin protein seviyeleri de yukarı doğru regüle etmiştir (Fig. 6A). İmmünohistokimyasal analizde AKK’nın böbrek dokusunda α-SMA, vimentin ve E-cadherin ekspresyonu üzerindeki etkisi ayrıca incelenmiştir (Şekil 6B). AKK, 5/6 Nx sıçanlarında α-SMA ve vimentin protein seviyelerini aşağı regüle etmiş ve E-cadherin protein seviyelerini yukarı regüle etmiştir. 

Şekil 6. 5/6Nx sıçanlarında AKK’nın renal interstisyel fibroz üzerindeki etkisi. (A, B, C) qPCR ile belirlenen α-SMA, vimentin ve E-cadherinin mRNA seviyeleri. (D, E) Böbrekte α-SMA, vimentin ve E-cadherin ekspresyonunun ve miktarının Western blot analizi. (F) (büyütme × 400) α-SMA, vimentin ve E-kadherin (kırmızı) ve DAPI boyama (mavi) antikorlarının immünofloresan analizinin temsili görüntüleri ve kantitatif analizi. Tüm veriler ortalama ± SEM (her grupta n = 5) olarak ifade edilmektedir. *p < 0.05, **p < 0.01, Kontrol grubuna karşı ve ^#p < 0.05, ^##p < 0.01, model grubuna karşı.

4. Tartışma

Raporlara göre KBH’nin en ciddi komplikasyonu, böbrek hastalığına sahip hastalarda morbidite ve ölümün ana nedeni olan mikrovasküler hastalıktır [28]. Hastaların çoğunda SEBH gelişir [29] ve bu durum sonunda böbrek yetmezliği, fonksiyon bozukluğu ve ölüme yol açar [30]. Araştırmamız, AKK ile tedaviden sonra KBH sıçanlarında böbrek hasarı, RIF, iltihaplanma ve bağırsak floral dengesizliğinin önemli ölçüde azaldığını göstermektedir. KBH sıçanları, idrar albüminin seviyelerinde dikkate değer bir artışla birlikte önemli böbrek yetmezliği (Scr ve BUN) göstermiştir. 8 hafta sonra AKK takviyesi bu maddelerin seviyelerini önemli ölçüde azaltmıştır. Bağırsak florası; inflamatuar bağırsak hastalığı [31], kardiyovasküler hastalık, diyabet ve ilgili diyabetik komplikasyonlar (diyabetik nefropati ve diyabetik kardiyovasküler komplikasyonlar gibi), böbrek hastalığı ve metabolik hastalığın [32] oluşumunda önemli bir rol oynamaktadır. Son çalışmalar böbrek-bağırsak eksenine işaret ederek KBH’nin bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkisini aydınlatmıştır [17]. KBH’nin bağırsak mikrobiyotasında disbiyozla sonuçlandığı gösterilmiştir [33]; bu durum indoksil sülfat, p-kresil sülfat, trimetilamin ve trimetilamin N-oksit dahil olmak üzere çeşitli üremik toksinlerin üretiminin artmasına yol açmakta ve bu da iltihaplanmayı yoğunlaştırarak KBH’nin SEBH ilerlemesini hızlandırmaktadır [34]. Klinik çalışmalarda KBH’a sahip hastalarda AKK bakteri bolluğunun önemli ölçüde azaldığı gösterilmiştir [35]. Bu çalışmada sıçanların bağırsak seviyelerini aynı temel seviyede yapmak için intragastrik antibiyotik uygulamasıyla bir psödoaseptik sıçan modeli oluşturulmuştur. Yong Rao ve arkadaşlarının çalışmasına göre [36], HFC farelerine 1 hafta boyunca ampisilin, vankomisin, neomisin ve metronidazol içeren oral ABX, ardından 6 hafta boyunca sadece ABX veya Aspergillus mucus verilmiştir. ABX içme suyunda çözülür. Annadora J. Bruce-KellerMice ve arkadaşları [23]; farelere 14 gün boyunca günde bir kez ampisilin, gentamisin, metronidazol, neomisin ve vankomisin kokteylleri vermişlerdir. 72 saat sonra fareler, her gün donör mikroflorasının intragastrik uygulamasıyla yeniden klonlanmıştır. Biz bu çalışmada bir haftalık intragastrik uygulama için antibiyotik kombinasyonunu seçtik ve bir haftalık yıkamadan sonra aynı topluluk ortamında sıçanların bağırsak mikroekolojisi düzeldi ve ardından intragastrik AKK uygulamasına başladık. Bu çalışmada bağırsak bakterilerinin bolluğu ve çeşitliliğinin, KBH ve normal sıçanlar arasında dikkate değer bir şekilde farklı olduğu bulunmuştur. İnsan ve sıçanların bağırsak florası, F/B oranı ile karakterize edilmektedir [37]. KBH sıçanlarında daha yüksek bir F/B oranı gözlemlenmiş ve AKK uygulaması bunu önemli ölçüde azaltmıştır. Çok sayıda çalışmada; Bacteroides, Lactobacillus, Bifidobacterium ve AKK bolluğunun bağırsak bütünlüğü, bağırsak sıkı bağlantıları ve azalmış plazma LPS konsantrasyonları ile pozitif korelasyona sahip olduğu gösterilmiştir [38]. Bu çalışmada AKK uygulaması, KBH grubundaki seviyelere kıyasla probiyotik bolluğunu önemli ölçüde artırmıştır. Araştırmamız, bunun KBH sıçan florası dengesiz olduğunda da belirgin olduğunu gösteriyor. Çalışmalar, KBH’lı hastaların bağırsak mikroekolojisindeki değişikliklerin bağırsak mukozal bariyer fonksiyonunu azalttığını göstermiştir [39]. Bağırsak mukozal bariyeri yok edilmiş ve eksprese edilen yapışkan proteinler ZO-1 ve claudin-2’nin miktarı önemli ölçüde azalmıştır. AKK müdahalesinden sonra bağırsak mukozal bariyer fonksiyonu düzelmiştir. Aynı zamanda, LPS üreten patojenler olarak, Proteobakteriler bağırsak dengesizliğine neden olabilmekte ve onların nispi bollukları KBH’li sıçanlarda daha yüksektir [40]; ancak AKK tedavisi sonrası bu durum tersine çevrilebilmektedir. Bu çalışmada Bağırsak mikroekolojisi ve LPS arasındaki ilişki analiz edilmiş ve önceki çalışmalarla tutarlı olarak serum LPS seviyesinin KBH sıçanlarının bağırsak florası ile pozitif korelasyon gösterdiği ve AKK uygulamasından sonra LPS seviyesinin düştüğü bulunmuştur. Kardiyovasküler hastalığı olan kişiler, Rhodophora rosea ve diğer bakteriler gibi daha az bütirat üreten bakteriye sahiptir [41].  Beklenmedik bir şekilde; AKK uygulamasından sonra Ruminococcus,  Oscillospira ve Roseburia’nın bolluğu önemli ölçüde artmıştır. Bu nedenle AKK, bağırsak mikrobiyal hastalıkları üzerinde yararlı bir etkiye sahiptir, AKK bağırsak florasının bolluğunu ve zenginliğini geri kazandırmakta, probiyotiklerin nispi bolluğunu ve çoğalma yeteneğini arttırmakta ve LPS üreten bakterilerin çoğalmasını azaltmaktadır. Endotoksin olarak da bilinen LPS, gram-negatif bakterilerin dış hücre zarından türetilmekte ve KBH ile ilişkili inflamasyonla ilişkili süreçleri tetiklediği düşünülmektedir. Sağlıklı bireylerde düşük sistemik LPS konsantrasyonları gözlemlenmiş, ancak KBH’li bireylerde yüksek konsantrasyonlar bulunmuştur. Bu durum metabolik endotoksemi olarak bilinir. Bağırsak mikrobiyotası KBH sırasında değişmekte, bu durumda bağırsak geçirgenliğinin artmasına ve sistemik bakteri ürünlerinin (LPS gibi) seviyelerinin artmasına yol açmaktadır. Artan inflamasyon endotoksemi ile ilişkilidir. LPS lenf ve dolaşım sistemlerine girmekte ve sistemik inflamasyona neden olabilmektedir. İnflamasyon, diyabetik nefropati ve hipertansif nefropati dahil olmak üzere kronik böbrek hastalığı ile ilişkilidir. KBH sırasında LPS’ye maruz kalma, büyük miktarlarda IL-1 ve IL-6 üretir. IL-1 ve IL-6 dahil olmak üzere proinflamatuar sitokinler, inflamatuar yanıtların başlatılması ve düzenlenmesinde yer almaktadır. Bu çalışmada IL-1 ve IL-6 seviyelerinde artışa yol açan aşırı endotoksin üretimi bulduk. Bununla birlikte AKK tedavisi, serumdaki LPS, IL-1 ve IL-6 seviyelerini önemli ölçüde inhibe etmiş ve bunun kronik renal interstisyumu iyileştirdiğini göstermiştir. Fibrozisten koruyucu etkiler, AKK’nın anti-inflamatuar özellikleri ile ilişkili olabilir. İnflamatuvar sitokinlerin düzensizliği ve immün yanıt TLR4 ile ilişkilidir ve renal fibrozis ve KBH riskine yol açabilir [42]. En kritik transkripsiyon faktörü olan nükleer faktör-κB (NF-κB), vücudun iltihaplanmasına ve bağışıklık tepkisine katılmakta [43] ve hücre apoptozunu ve stres tepkilerini düzenleyebilmektedir [44]. KBH sıçanları yüksek seviyelerde TLR4 ve NF-κB göstermektedir [42]. İnflamatuar faktörlerin, IL-6 ve IL-1β konsantrasyonlarının arttığını bulduk. Artan sayıda çalışma, kronik inflamasyonun fibrotik yanıtın başlatılmasında ve fibrozis sürecinde hayati bir rol oynadığını göstermiştir [45]. Bu çalışmada AKK, bağırsak mikroplarının homeostazını restore ederek, bağırsak mukozal bariyer fonksiyonunu iyileştirerek, proinflamatuar sitokinlerin salınımını azaltarak ve LPS gibi endotoksinlerin birikimini azaltarak KBH sıçanlarında böbrek iltihabı üzerinde yararlı bir etkiye sahipti. Profibrotik proteinler, proinflamatuar sitokinler (IL-1β ve IL-6) tarafından üretilebilir ve aktive edilebilir ve ayrıca dingin fibroblastların fibroblast salgılayan bir matrise diferansiyasyonunu teşvik eder, böylece fibroblast büyümesini destekler [46]. Çalışmamızda 5/6 Nx sıçanlarda IL-1β ve IL-6 seviyeleri anlamlı olarak artmış ve AKK müdahalesinden sonra IL-1β ve IL-6 ekspresyonu azalmıştır. Bu, AKK’nın bağırsak homeostazını iyileştirerek 5/6 Nx sıçanlarında inflamatuar durumu azaltabileceğini düşündürmektedir. α-SMA’nın aşırı ekspresyonu ve aşırı ECM birikimi, matris metalopeptidaz 2 (MMP-2) üretimini inhibe edebilir ve sonuçta kolajenin degradasyonunu azaltabilir [47]. α-SMA; kollajen I, kollajen III, fibronektin ve diğer ECM bileşenlerinin sentezinde yer alan miyofibroblast aktivasyonunun bir belirtecidir ve renal fibrozis gelişimini destekler [42]. Sonuçlarımız, KBH grubundaki sıçanlar AKK ile tedavi edildiğinde serum IL-1β ve IL-6 seviyelerinin düştüğünü göstermektedir. Üç boyamanın patolojik sonuçları, renal interstisyel fibrozis seviyesinin azaldığını, fibrozis işaret proteinleri α-SMA ve vimentin ekspresyonunun azaldığını ve E-cadherin ekspresyonunun arttığını göstermiştir. Sonuçlar ayrıca AKK’nın yararlı anti-inflamatuar ve anti-fibrotik etkilere sahip olduğunu göstermiş ve fibrozis ile ilişkili hastalıklarda potansiyel terapötik etkilerine dair kanıt sağlamıştır.

Sonuç olarak AKK bakterileri; KBH farelerinin bağırsak mikroekolojik ortamını iyileştirebilen, bağırsak bariyer fonksiyonunu restore edebilen, bağırsak toksinlerinin üretimini azaltabilen ve KBH’de iltihaplanma seviyesini azaltabilen böylece inflamatuar aktivasyonun neden olduğu kronik renal interstisyel fibrozu iyileştirebilen potansiyel yeni probiyotiklerdir.