Kilittaşı Kommensal Bakterisi Christensenella minuta DSM 22607, Hem İn Vitro Hemde İn Vivo’da Anti-İnflamatuar Özellikler Sergiler

Christensenellaceae, insanlarda bulunan bir subdominant kommensal bakteri ailesidir. Mikrobiyal simbiyozu koruyarak bağırsak sağlığında önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Aslında, bu bakteriler önemli ölçüde daha düşük seviyelerde görülmekte veya iltihaplı bağırsak hastalıklarından (IBD’ler) muzdarip bireylerde bulunmazlar. Burada, Christensenella minuta türlerinin (suş: DSM 22607) IBD’lerin tedavisine yardımcı olma potansiyeline sahip olup olmadığını araştırdık. In vitro ve in vivo deneylerin bir kombinasyonunu kullanarak bakteri tarafından sergilenen temel özellikleri değerlendirdik.  C. minuta’nın zorunlu bir anaerob olmasına rağmen oksijene toleranslı olduğunu bulduk. Ayrıca, türün yüksek düzeyde asetat ve orta düzeyde bütirat ürettiğini gözlemledik. Biolog mikrodizilerini kullanarak derin fenotipleme yaptık. İnsan bağırsak hücre dizilerini kullanarak, C. minuta’nın NF-κB sinyal yolağının inhibisyonu yoluyla proinflamatuar IL-8 sitokinlerinin seviyelerinin azalması sonucu güçlü anti-inflamatuar aktivite gösterdiğini keşfettik. Ayrıca C. minuta in vitro olarak bağırsak epitel bütünlüğünü korumuştur. Sonuç olarak iki farklı akut kolit hayvan modelinde, C. minuta bağırsak hasarını önlemiş, kolonik inflamasyonu azaltmış ve mukozal iyileşmeyi desteklemiştir. Bu sonuçlar, C. minuta’nın güçlü immünomodülatör özelliklere sahip olduğunu ve yenilikçi mikrobiyom temelli IBD biyoterapilerinde potansiyel kullanımının vurgulandığını göstermektedir.

İnflamatuar bağırsak hastalıkları (IBD’ler); interlökin-8 (IL-8) sitokinleri seviyelerinin arttığı^3,4 ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı üretildiği⁵ kontrolsüz ve zararlı bir inflamatuar yanıtı^1,2 tetikleyen gastrointestinal sistemin kronik anormal inflamasyonu ile karakterize edilen rahatsızlıklardır. İki ana IBD türü, her biri farklı fizyolojik semptomlar gösteren Crohn hastalığı (CD) ve ülseratif kolittir (UC)⁶.  IBD’lerin etiyolojisi tam olarak anlaşılmamış olsa da, birbirine bağlı karmaşık bir çevresel⁷, genetik⁸ ve immün⁹ faktörlerinin söz konusu olduğunu biliyoruz. IBD tetikleyicileri de çok az karakterize edilmiştir ancak en iyi desteklenen hipotez, bağışıklık sistemi bozulmalarının bağırsak kommensal bakterileri ile insan konakçıları arasındaki çapraz-karışma dengesizliklerine neden olduğudur². Aslında birçok çalışmada, CD veya UC’den muzdarip bireylerin, Firmicutes ve Bacteroidetes filumlarındaki kommensal bakterilerde bir azalma ile karakterize edilen ve Gammaproteobacteria^10-13 sınıfındaki bakterilerde bir artışa izin veren mikrobiyal disbiyoz sergilediği bulunmuştur. Bu disbiyoza, inflamasyon yollarını ve bağışıklık sistemi modülasyonunu¹⁴ etkileyebilen kısa zincirli yağ asidi (SCFA) üretimindeki ^14,15 değişiklikler eşlik eder.

Bağırsak mikrobiyotasındaki uygun denge sağlığın korunmasına yardımcı olduğundan, IBD ile ilgili disbiyozun ele alınması için stratejiler geliştirilmiştir. Bugüne kadar fekal mikrobiyota transplantasyonu (FMT)¹⁶ ve izole bakteri¹⁷ kullanılan uygulamalar umut verici sonuçlar sağlamıştır. FMT’nin Clostridium difficile enfeksiyonlarının tedavisinde etkili olduğu gösterilmiştir¹⁸; IBD’lerden muzdarip olanların mikrobiyotasını düzeltmeye de yardımcı olabilir, ancak IBD vakalarında rutin kullanımını desteklemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır¹⁹. Aslında, bu yöntemin kurulması ve kontrol edilmesi zor olabilir. Donör seçimi özellikle önemli bir husustur²⁰ çünkü donör uyuşmazlığı besin emiliminde değişikliklere yol açabilir, kronik hastalıkların başlamasını teşvik edebilir veya istenmeyen mikroorganizmaları transfer edebilir²¹. Son zamanlarda fare modellerinde tek bakteri suşlarının kullanıldığı uygulamalar, bağırsak mikrobiyal popülasyonlarını²² modüle etmek ve doku hasarını ve pro-inflamatuar sitokinlerin^12,23-26 düzeylerini azaltarak gastrointestinal sağlığı iyileştirmek için başarıyla kullanılmıştır. Ayrıca, insanlarda bu yaklaşımlar disbiyozu düzeltebilir ve inflamatuar aracıların miktarını azaltabilir, iyileşme sürecine öncülük edebilir²⁷.

2017’deki araştırma, yakın zamanda tanımlanan Christensenellaceae familyasının bağırsak sağlığında²⁸ önemli bir rol oynadığını göstermiştir: bu bakteriler simbiyotik bağırsak mikrobiyomunun gelişiminde kilittaşı türler olarak hizmet etmektedir. Christensenella; Firmicutes filumunun ve Clostridiales takımının bir parçasıdır ve üyeleri zorunlu anaerobik, Gram negatif, spor oluşturmayan ve hareketsiz bakterilerdir²⁹. Bu aile, oldukça kalıtsal bir takson olarak tanımlanmıştır ve diğer kalıtsal taksonları içeren birlikte-oluşum ağında bir merkez olarak hizmet ederler³⁰. Çalışmalarda; CD veya UC’den muzdarip bireylerin bağırsak mikrobiyotalarında Christensenellaceae düzeylerinin önemli ölçüde daha düşük olduğu veya tamamen yoksun olduğu bulunmuştur^31,32. Ayrıca CD’li bireylerde, bolluktaki bu tür azalmalar yüksek derecede alevlenmeleri öngörmektedir³³. Son zamanlarda, bağırsak mikrobiyotasındaki IBD ile ilgili değişikliklerin, inflamasyon dinamiklerine ve ayrıca dengeyi ve genel homeostaziyi geri kazanmanın anahtarı olan kommensal bakteri kaybına katkıda bulunduğu keşfedilmiştir³⁴. Bu bulgular birlikte ele alındığında, Christensenellaceae’nin bolluğu ile IBD’lerin oluşumu arasında güçlü bir bağlantı olduğunu ve bu ortak bakterilerin bağırsak fizyolojisinde merkezi bir rol oynayabileceğini göstermektedir.

Burada, Christensenella türlerinin bağırsak mukozasını koruyan anti-inflamatuar özelliklere sahip olduğunu varsaydık. Bu hipotezi test etmek için, ilk önce Christensenella minuta DSM 22607 tip türü tarafından sergilenen çeşitli özellikleri; yani oksijen duyarlılığını, metabolik profilini ve SCFA’ları üretme kabiliyetini tanımladık. Daha sonra in vitro olarak, bakterinin insan kolon hücrelerinde inflamasyonu ne kadar iyi modüle ettiğini ve inflamasyon sırasında bağırsak bariyer bütünlüğünü koruduğunu değerlendirdik. Sonuç olarak, C. minuta DSM 22607’nin in vivo olarak kemirgenlerde iki farklı preklinik kolit modelinde inflamasyonu azaltıp azaltamayacağını araştırdık. Hipotezimiz için destek bulduk – bu bakteri türleri, mikrobiyom temelli IBD biyoterapileri için umut oluşturabilir. 

Sonuçlar

Kısa zincirli yağ asitleri üreten oksijene toleranslı bir anaerob. C. minuta DSM 22607’yi daha iyi karakterize etmek için önce suşun oksijen duyarlılığını değerlendirdik. Bakterinin en az 24 saat oksijen varlığını tolere edebildiğinden oksijene aşırı duyarlı (EOS) olmadığını bulduk (Şekil 1a). Daha sonra farklı büyüme evrelerinde (latent, üstel ve durağan) SCFA üretimini ölçtük (Şekil 1b,c). C. minuta’nın başka yerlerde de görüldüğü gibi²⁹ yüksek düzeyde asetat ve orta düzeyde bütirat üretebildiğini gözlemledik; aksine hiçbir propiyonat üretilmemiştir. Sonuçlarımız üç büyüme fazının tümü boyunca, SCFA üretim oranlarının aynı kaldığını göstermektedir: her 5 mol asetat için yaklaşık 1 mol butirat.

Şekil 1. Christensenella minuta’da oksijen duyarlılığı ve metabolit üretimi. (a) 0, 2, 4 ve 24 saatlik oksijene maruz kaldıktan sonra bakteri sayıları (CFUs/mL). (b) Optik yoğunluk ve koloni oluşturan birimler (CFU’lar) açısından ifade edilen zaman içindeki büyüme. Oklar, farklı örnekleme noktalarını göstermektedir. (c) Farklı numune alma noktalarında bütirat ve asetat üretimi.

Bakterinin ayrıntılı metabolik fenotipi. Biolog mikro-tahliller kullanarak C. minuta için kapsamlı bir fenotipik profil elde ettik. Üç bağımsız tekrar gerçekleştirdik. C. minuta’nın N-asetil-D-glukozamin, D-arabitol, arbutin, D-selobiyoz, dekstrin, D-fruktoz, L-fukoz, D-galaktoz, α-D-glukoz, maltotrioz, D-mannitol, D-mannoz, 3-metil-D-glukoz, palatinoz, salisin, turanoz, fumarik asit, piruvik asit, L-fenilalanin, 2′-deoksiadenozin, inozin ve üridinin metabolize edebildiğini bulduk (Tablo 1). 

Tablo 1. Christensenella minuta suşu DSM 22607’nin metabolik profili.

HT‑29 hücrelerinde IL‑8 üretimini sınırlama ve NF‑κB aktivasyonunu inhibe etme yeteneği. İnsan HT-29 hücrelerini kullanarak, C. minuta ve süpernatantının, TNF-α kaynaklı IL-8 salgılanmasını ne kadar iyi modüle edebildiğini ve böylece iltihabı sınırladığını analiz ettik. IL-8 önemli bir pro-inflamatuar sitokindir ve bu nedenle salgılanmasını inhibe edebilen bakterilerin antiinflamatuar etkileri vardır³⁵. Hem süpernatant (Şekil 2a) hem de bakterinin kendisi (Şekil 2b) anti-inflamatuar özellikler göstermiştir: IL-8 üretimi her iki durumda da yaklaşık %50 azalmıştır. Bu inhibisyon seviyesi, IBD’leri tedavi etmek için yaygın olarak kullanılan bir bileşik olan 5-ASA ile ilişkili olana benzemektedir. Enfeksiyonun farklı çokluklarında (MOI’ler) birlikte inkübasyon meydana geldiğinde, inhibisyon yüzdesinin %0 (MOI 10) ile %50 (MOI 50) arasında değiştiği bir doz-yanıt etkisi gözlemledik (Şekil 2b). Süpernatantın %2 (v/v), %10 (v/v) ve %20 (v/v)’si ile benzer sonuçlar elde edilmiştir. Ayrıca C. minuta’nın, IL-8 üretimi³⁷ dahil olmak üzere bağışıklık tepkilerini³⁶ düzenleyerek iltihaplanmada önemli bir rol oynayan NF-κB yolağı üzerindeki etkilerini araştırdık. Bakteriyel süpernatant, NF-κB aktivasyonunu %40 oranında azaltmıştır, bu kontrol NF-κB inhibitörü BAY 11-7082’nin (10 µm)’kine benzer bir etkidir (Şekil 2c). Buna karşılık, bakteri tek başına kullanıldığında hiçbir etki gözlemlenmemiştir (veriler gösterilmemiştir). Böylece C. minuta’nın kültür ortamına güçlü bir anti-inflamatuar efektör salgıladığı sonucuna vardık.

Şekil 2. Christensenella minuta’nın in vitro anti-inflamatuar özellikleri. (a) C. minuta süpernatantının veya (b) C. minuta bakterilerinin varlığında TNF-α’ya maruz bırakılan HT-29 hücreleri tarafından IL-8 üretimi. (c) Bir raportör sistemle transfekte edilmiş ve TNF-α’ya maruz bırakılmış HT-29 hücrelerinde NF-κB aktivasyon seviyeleri. Kontrol gruplarını diğer gruplarla karşılaştıran Mann Whitney U testinin sonuçları: *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001.

Caco‑2 hücrelerinde bariyer bütünlüğünü sürdürme yeteneği. C. minuta’nın sıkı bağlantıları bozan, epitelyal bariyer geçirgenliğini artıran ve iltihaplanmaya neden olan TNF-α’ya maruz kalan Caco-2 hücrelerinde transepitelyal elektrik direncini (TEER) ölçerek in vitro hücre modelinde bağırsak bariyer bütünlüğünü koruyup koruyamayacağını değerlendirdik. Ölçümler, TNF-α’ya maruz kaldıktan hemen önce ve 24 saat sonra yapılmıştır. Caco-2 hücreleri, Dulbecco’nun modifiye Eagle’s ortamında (DMEM) önceden 3 saat boyunca C. minuta ile işlem gördüğünde TEER oranının sabit kaldığını gözlemledik (Şekil 3). Bu sonuç görünürde bağırsak bariyerini koruyan farklı efektörlerin anti-inflamatuar etkisi yoluyla bariyer bütünlüğünün korunduğunu göstermektedir.

Şekil 3. Christensenella minuta’nın bağırsak bariyeri geçirgenliği üzerindeki etkileri. Caco-2 hücrelerinin polarize tek tabakaları, bağırsak bariyerini bozmak için TNF-α’ya maruz bırakılmıştır. TEER, TNF-α maruziyetinden hemen önce ve 24 saat sonra ölçülmüştür. DMEM + TNF-α grubunu diğer gruplarla karşılaştıran Mann Whitney U testlerinin sonuçları: *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001.

DNBS ile uyarılmış kolite karşı önleme ve koruma yeteneği. C. minuta’nın in vitro görülen anti-inflamatuar özelliklerinin in vivo olarak da gözlenip gözlemlenmediğini belirlemek için bir deney gerçekleştirdik.  Uygulama farelerine 14 gün boyunca günlük C. minuta dozları verilmiştir. Kolit daha sonra intrarektal bir DNBS enjeksiyonu ile indüklenmiş ve farelere 3 gün sonra ötanazi yapılmıştır. Bu fark anlamlı olmasa da, uygulama grubunun DNBS-vehikül grubundan daha hızlı vücut kütlesi kazanma eğiliminde olduğunu bulduk (Şekil 4a). Ayrıca uygulama grubundaki mikroskobik skorlarda, restore edilmiş kolonik epitel yapısını ve azalmış immün hücre infiltrasyonunu yansıtan bir düşüş gözlemledik (Şekil 4b). Makroskopik skorlarda da benzer bir model görülmüştür (Şekil 4d). Bakterinin kolon dokusu üzerindeki anti-inflamatuar etkilerini değerlendirmek için, nötrofillerin hücre içi granüllerinde bulunan bir enzim olan myeloperoksidazın (MPO) aktivitesini karakterize ettik³⁸. DNBS ile indüklenen inflamasyonun, artan nötrofil infiltrasyonu ve MPO aktivitesi ile sonuçlandığını gözlemledik; bu etkiler C. minuta ile gavaj uygulanan tedavi grubunda önemli ölçüde daha az belirgindi (Şekil 4e).

Şekil 4. Christensenella minuta’nın farelerde DNBS-kaynaklı iltihaplanma üzerindeki etkileri. (a) Kolit oluşturulduktan sonra vücut kütlesindeki değişiklik; (b) kolon mikroskobik skorları; (c) kolon makroskopik skorları; ve (d) MPO aktivite seviyeleri. DNBS-Vehikül grubunu diğer üç grupla karşılaştıran Mann Whitney U testlerinin sonuçları: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 ve ****p < 0.0001.

TNBS ile uyarılmış kolite karşı önleme ve koruma yeteneği. Bakterinin in vivo anti-inflamatuar etkilerinin ek onayını elde etmek için, inflamasyona daha duyarlı olduğu bilinen TNBS ile indüklenen kolitli farelerde deneyi ikinci bir modelde tekrarladık ³⁹. Uygulama sıçanlarına 14 gün boyunca günlük C. minuta dozları verilmiştir. Kolit daha sonra intrarektal bir TNBS enjeksiyonu ile indüklenmiş ve farelere 4 gün sonra ötenazi yapılmıştır. Fare modelinin aksine uygulama grubu deney sonundaki TNBS-vehikül grubu ile karşılaştırıldığında, vücut kütle kazancı üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır (Şekil 5a). Ancak kolon kütlesi uygulama grubunda daha düşüktür (Şekil 5b), bu da bağırsak geçişinin C. minuta tarafından iyileştirildiğini gösteriyor. Dikkat çekici bir şekilde, makroskopik skorlar (yani Wallace skorları⁴⁰; Şekil 5c), C. minuta’nın kolon dokusunu korumada UC⁴¹‘i tedavi etmek için kullanılan bir bileşik olan 5-ASA kadar etkili olabileceği fikrini desteklemiştir. Ayrıca, tedavi grubu için mikroskobik skorlar, TNBS-vehikül grubunda görülene kıyasla, inflamatuar profillerin histolojik düzeyde (Şekil 5d) iyileşmiş göründüğünü göstermiştir. Ayrıca, C. minuta uygulamasının, IL-1β salgısını azaltarak bir immünomodülatör yanıtı indüklediği görülmüştür (Şekil 5e). Bu sonuç özellikle TNBS ile indüklenen Th1 yanıtının azaltıldığını göstermektedir. IL-6 ve IL-10 üretimi (sırasıyla Th2 ve Th1 sitokinlerinin) TNBS enjeksiyonundan etkilenmemiştir (veriler gösterilmemiştir). Son olarak, bağırsak iltihabının invaziv olmayan bir biyolojik belirteci olarak lipokalin-2’yi (LCN-2) kullandık.  C. minuta uygulaması kolondaki LCN-2 konsantrasyonunu düşürme eğilimindeydi (Şekil 5f). Bu sonuçlar, iki in vivo kolit modelinde bakterinin antiinflamatuar özelliklerini göstererek in vitro bulgularımızı doğrulamıştır. 

Şekil 5. Christensenella minuta’nın sıçanlarda TNBS-kaynaklı inflamasyon üzerindeki etkileri. (a) Deney boyunca vücut kütlesi; (b) deneyin sonunda kolon kütlesi; (c) kolon mikroskobik skorları; (d) kolon makroskopik skorları; kolon IL-1β seviyeleri (e) ve (f) kolon nötrofil infiltrasyonu için bir vekil olan LCN-2 seviyeleri. TNBS-Vehikül grubunu diğer üç grupla karşılaştıran Mann Whitney U testlerinin sonuçları: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 ve ****p < 0.0001.

Tartışma 

IBD’ler, şu anda hiçbir iyileştirici tedavisi bulunmayan, güçten düşüren kronik hastalıklardır. Araştırmamız, mikrobiyom temelli tedavilerin bağırsak mukozasını iyileştirmek için yenilikçi bir yaklaşım sunduğu fikrine dayanmaktadır. Aslında, bazı kommensal bakterilerin IBD semptomlarını iyileştirebilen anti-inflamatuar özelliklere sahip olduğuna dair artan kanıtlar bulunmaktadır^10-12.

2012’de Morotomi ve ark.⁴², varlığı daha sonra bağırsak mikrobiyota sağlığı ile ilişkili olduğu bulunan yeni bir bakteri ailesi olan Christensenellaceae’yi tanımlamışlardır²⁸. Bu takson, mikrobiyomun altbaskın bir üyesi olmasına rağmen birlikte-oluşum analizleri, bağırsak ekosisteminde daha geniş bir kalıtsal bakteri ağı içinde merkezi bir rol oynadığını ortaya koymuştur^30,43. Aslında, IBD’li bireyler bağırsaklarında bu bakterilerin önemli ölçüde daha düşük seviyelerini göstermektedirler, bu da Christensenella türlerinin bolluğu daha düşük olduğunda bağırsak iltihabının daha fazla olduğunu düşündürmektedir^31,44,45. Sonuç olarak, IBD tedavilerinde kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için Christensenella minuta’nın (DSM 22607) anti-inflamatuar özelliklerini araştırdık.

İlk olarak, genel metabolik kapasiteleri hakkında fikir edinmek için bakterinin metabolik fenotipini tanımladık. C. minuta’nın bir anaerob olmasına rağmen, EOS olan Faecalibactium prausnitzii gibi diğer anaerobik kommensal bakterilerin aksine oksijene oldukça toleranslı olduğunu bulduk. Aslında son araştırmalar Christensenella’nın insan bağırsağının oksijen konsantrasyonlarına göre değişen farklı bölümlerinde (yani terminal ileum^13,44, çekum⁴⁶ ve distal kolon⁴⁷) oluştuğunu keşfetmiştir. Bu bulgular, C. minuta’nın üst gastrointestinal sistemde ve özellikle Crohn hastalığında önemli bir inflamasyon bölgesi olan distal ileumda yararlı etkileri olabileceği fikrini desteklemektedir; aksine, diğer aday EOS bakterileri yalnızca kolonda oluşmaktadır. IBD’ler oksidatif stres ve yüksek ROS⁵ seviyeleri ile ilişkili olduğundan, C. minuta’nın oksijeni tolere etme yeteneği, bağırsakta inflamasyonun neden olduğu oksidatif strese direnç sağlayabilir. Bu nedenle bakteri, daha hassas anaerob türlerin oluşmasına izin veren çevresel koşullar yaratmaya çok uygun olabilir. Aslında, IBD⁴⁸ sırasında kolonda gözlemlenen fakültatif anaerobların artan varlığı, EOS adaylarına karşı bir biyoterapi olarak C. minuta’ya büyük bir avantaj sağlayabilir. Bakterinin oksijen toleransı, endüstriyel üretim süreçlerinde kullanımını da kolaylaştırabilir; bu C. minuta’nın faydalarının mikrobiyom temelli klinik tedavilere dönüştürülmesi için pratik bir değerlendirmedir. 

Ayrıca C. minuta’nın yüksek seviyelerde asetat ve orta seviyede bütirat^29,49 ürettiğini doğruladık ve asetat:bütirat üretim oranının üç büyüme fazının tamamında 5:1 olduğunu gösterdik. Yaygın olarak bağırsak bakterileri tarafından üretilen SCFA’lar, karbonhidrat fermantasyonundan ve daha az oranda protein fermentasyonundan kaynaklanır⁵⁰. İlginç bir şekilde, bir dizi bakteri ya asetat ya da bütirat üreticisi olarak tanımlanmıştır, ancak ikisi birden nadirdir⁵¹. SCFA’lar; kolon, hepatik, kas ve yağ dokularında bulunan G-protein-bağlı reseptörler (GPR’ler) ile etkileşimler yoluyla konakçı yolakları modüle ettiklerinden önemli bileşiklerdir⁵². Bu etkileşimler, hücre farklılaşması ve enerji metabolizması ile ilgili birçok önemli işlevi etkiler. Bütirat reseptörü GPR109a ayrıca bağırsak epitel hücrelerinde, adipositlerde ve bağışıklık hücrelerinde meydana gelir ve burada inflamasyonu ve hücre proliferasyonunu kontrol etmeye yardımcı olur⁵³. SCFA üretimindeki azalmalar, esas olarak konakçı-mikrop etkileşimlerini etkileyerek zararlı etkilere sahip olabilmektedir³⁴. Sonuç olarak, dengeli SCFA üretimi, bağırsak homeostazı için esastır.

SCFA’lar, immünomodülatör özellikleri⁵⁴ yoluyla mikrobiyota-konakçı karışmasını etkileyebileceğinden, C. minuta’nın inflamasyon üzerinde bir etkisi olup olmadığını araştırdık. Hem C. minuta bakterilerinin hem de onların süpernatantının, TNF-α kaynaklı iltihaplanmayı takiben HT-29 hücreleri tarafından IL-8 sitokinlerinin salgılanmasını azaltan güçlü anti-enflamatuar özellikler sergilediğini keşfettik. Bu tür anti-enflamatuar özellikler, Faecalibacterium prausnitzii⁵⁵, çeşitli Lactobacillus türleri⁵⁶ ve Akkermensia muciniphila²⁴ dahil olmak üzere diğer bakterilerde de görülmüştür.

Bakterinin anti-inflamatuar etkilerini daha fazla araştırmak için, hem bakterinin hem de süpernatantının, IL-8 üretimini düzenlediği bilinen bir NF-κB raportör sistemi ile transfekte edilmiş HT-29 hücrelerine karşı etkisini test ettik³⁷. Sadece süpernatant NF-κB aktivasyonunu azaltmıştır. Bu sonuç, önceki deneyin bulgularıyla birleştiğinde, gözlemlenen etkilerden en az iki farklı bakteriyel efektörün sorumlu olduğunu göstermektedir. Çeşitli komensal ve patojenik mikroorganizmaların kullanıldığı geçmişteki çalışmalar, bakterilerin doğal NF-κB yolağını modüle etmek için çeşitli mekanizmalar kullandığını göstermiştir⁵⁷. Süpernatandaki (fizyolojik konsantrasyonlardan⁵⁸ yaklaşık 10 kat daha düşük olan) bütirat konsantrasyonlarının NF-κB yolağını⁵⁹ inhibe etmesine yardımcı olması mümkündür. Polisakkaritler⁶⁰, peptidoglikanlar⁶¹ ve proteinler⁶² gibi diğer bileşikler de süpernatant içine salgılanmış veya bakteri zarının yüzeyine maruz kalmış olabilir⁶³. Altta yatan mekanizmaları çözmek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

Daha sonra, bir Caco-2 hücre hattı kullanarak C. minuta’nın TNF-α-kaynaklı geçirgenliğinden epitel hücrelerini ne kadar iyi koruyabildiğini değerlendirdik. Bakterinin, indüklenen iltihaplanmayı takiben epitel hücre tek tabakasının bütünlüğünü başarıyla koruduğunu bulduk. IBD’li bireyler, bağırsak geçirgenliğini düzenleyen adezyon moleküllerinin çok düşük seviyelerine sahiptir⁶⁴; C. minuta, uygun geçirgenliği onarmaya ve meydana gelen herhangi bir hasarı sınırlamaya yardımcı olabilir. Son çalışmalar, Escherischia coli Nissle 1917’nin, özellikle MLCK-P-MLC sinyal yolağının NF-κB aracılı aktivasyonunu inhibe ederek, TNF-α ve IFNy tarafından indüklenen TEER’deki düşüşleri azaltabileceğini vurgulamıştır⁶⁵. F. prausnitzii ve Roseburia intestinalis’in ayrıca sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonunu modüle ederek ve hücreler arası geçirgenliği azaltarak bozulmuş epitel bariyer fonksiyonunu tersine çevirmeye yardımcı olduğu bulunmuştur⁶⁶. C. minuta tarafından kullanılan kesin mekanizmayı çözmek faydalı olacaktır.

C. minuta’nın in vivo olarak aynı anti-inflamatuar özellikleri gösterip göstermediğini belirlemek için, iki farklı kolit hayvan modelini: orta, DNBS ile indüklenen kolitin bir fare modeli ve şiddetli, TNBS ile indüklenen kolitin bir sıçan modeli³⁹ kullanarak deneyler gerçekleştirdik. Makroskopik skorlara dayalı olarak C. minuta ile tedavi, her iki modelde de kolon hasarını önemli ölçüde sınırlamıştır. Bakterinin immünomodülatör etkilerini karakterize etmek için MPO aktivitesini (farelerde) ve LCN-2 seviyelerini (sıçanlarda) izleyerek kolonik dokularda nötrofil infiltrasyonunu değerlendirdik. Her iki modelde de, C. minuta ile tedavi edilen hayvanlarda metrikler daha düşüktür. Benzer çalışmalarda, Parabacteroides distasonis⁶⁷ temelli bir tedavi kullanılarak TNBS kaynaklı kolitin bir fare modelinde ve F. prausnitizii⁶⁸ ve farklı Lactobaccillus suşlarına⁵⁶ dayalı bir tedavi kullanılarak DNBS kaynaklı kolitin bir fare modelinde karşılaştırılabilir etkiler bulunmuştur. Bu bulgular birlikte ele alındığında tek suşlu kolit tedavilerinin kullanılmasının etkili olabileceğini göstermektedir⁶. IL-8 salgılanmasının iltihaplı bölgelerde nötrofil aktivasyonunu indüklediği gösterilmiştir^69,70. C. minuta’nın in vitro olarak IL-8 salgılanmasını ve NF-κB aktivasyonunu azalttığı göz önüne alındığında, bu sinyal yolağı nötrofil aktivasyonunun azalmasında ilgili olabilir. Ayrıca, C. minuta uygulanan sıçanlarda IL-1β’de bir azalma görülmüştür (Şekil 5e). IL-1β sinyaline, NF-κB⁷¹ dahil olmak üzere çoklu transkripsiyon faktörleri aracılık etmektedir. TNBS kaynaklı kolit modelinde sitokin salınımının, C. minuta’nın NF-κB inhibitörlerini salgılaması ile kısmen modüle edilmiş olması mümkündür. Benzer bir etki şekli; farklı kolit modellerinde⁶² F. prausnitzii’de, özellikle mikrobiyal anti-inflamatuar molekülün (MAM) salınımı yoluyla görülmüştür. NF-κB sinyal yolağı patojenlere karşı ana savunma hattı olarak hizmet etse de, artan proinflamatuar sitokin üretimi nedeniyle aşırı aktif hale getirildiğinde zararlı etkileri olabilir⁷². Sonuç olarak, inflamasyon gelişiminin durdurulabilmesi için hangi moleküllerin yol aktivasyonunu kontrol etmeye yardımcı olduğunu belirlemek önemlidir. Örneğin, bütirat gibi SCFA’lar, inhibitör etkileri yoluyla inflamasyonu sınırlayabilir⁷³.

Sonuç olarak, çalışmamız C. minuta’nın in vitro ve in vivo’da güçlü immünomodülatör özellikler sergilediğini gösteren ilk çalışmadır. Bulgularımız ilgi çekici yeni araştırma sorularına kapı aralıyor. Bakterinin etkilerini ve altta yatan mekanizmalarını daha iyi anlamak için ek araştırmalara açıkça ihtiyaç duyulmasına rağmen, çalışmamız C. minuta’nın IBD’leri tedavi etmek için umut vaat ettiğini ve tek suşlu biyoterapiler geliştirmek amacıyla daha fazla çalışmayı hak ettiğini vurgulamaktadır. 

Methotlar

Bakteri kültürü yapmak. Christensenella minuta (DSM 22607) 37 °C’de tutulan bir anaerobik hazne (%5/%5/%90 CO2, H2, N2) içinde Gifu anaerobik besiyerinde (GAM broth, HyServe) kültürlenmiştir. Gerektiğinde granüle agar (15 g/L, Difco) eklenmiştir. Bakteri kültürleri 2500 x g’de santrifüjlendi ve ardından 1X Dulbecco’nun fosfat tamponlu salininde (DPBS, Gibco) yeniden süspanse edilmiştir. Daha sonra bu kültürler aşağıda açıklanan in vitro ve in vivo deneylerde kullanılmıştır. Büyüme eğrilerini oluşturmak için kültürler, tüm büyüme döngüleri boyunca (54 saate kadar) takip edilmiştir. Optik yoğunluğu (OD600) ölçmek ve böylece bakteri sayılarını tahmin etmek için bir spektrofotometre (Ultrospec 10) kullanılmıştır. Kültür örnekleri farklı zaman noktalarında toplanmış ve 4000 x g’de 4 °C’de 15 dakika santrifüjlenmiştir. Süpernatanlar toplanmış ve kısa zincirli yağ asidi (SCFA) konsantrasyonlarını ölçene kadar -20 °C’de saklanmıştır.

Kısa zincirli yağ asidi konsantrasyonlarının karakterize edilmesi. Bakteriyel süpernatanlar fosfotungstik asit (%10 [v/v]); Sigma) ilavesiyle gece boyunca 4 °C’de proteininden arındırılmıştır. Daha sonra elde edilen numuneler 12,000×g’de 15 dakika santrifüj edilmiştir. SCFA’ların konsantrasyonları, Split-splitless bir enjektör (GC Agilent 7890B) bir alev iyonizasyon detektörü ve SP 1000 (Nukol; Supelco 25,236) ile paketlenmiş bir kılcal kolon (15 m x 0,53 mm x 0,5 um) ile donatılmış bir gaz kromatografı (GC; Agilent 6890 N Ağı) kullanılarak belirlenmiştir. Taşıyıcı gaz olan hidrojenin akış hızı 10 mL/dak; enjektör, kolon ve dedektör sıcaklıkları sırasıyla 200 °C, 100 °C ve 240 °C idi. Örneklerimizde dahili standart olarak 2-etilbutirat ve bir SCFA standartları paneli kullanılmıştır. Her numune için iki tekrar yapılmıştır. SCFA verileri toplanmış ve GC’nin varsayılan yazılımını (Agilent) kullanarak pikler entegre edilmiştir. SCFA’ların nihai konsantrasyonlarını belirlemek için, uygun çarpma faktörünü (yani, süpernatant numune kütle oranı) elde etmek için süpernatanlar protein çökeltmesinden önce ve sonra tartılmıştır. 

Oksijen duyarlılığının değerlendirilmesi. C. minuta’nın oksijene duyarlılığını değerlendirmek için yukarıda açıklanan kültürlerdeki bakterileri kullanılmıştır⁵⁵. Kısaca sıvı besiyerinde 48 saat boyunca C. minuta üretilmiştir. Daha sonra, bakterilerin farklı konsantrasyonlarından (nihai konsantrasyon aralığı: 10⁴–10⁹ CFU/mL) 10-μL numuneler alınmış ve bunlar petri kaplarına yerleştirilmiştir. Kutular anaerobik haznenin dışına yerleştirilmiş ve 2, 4 ve 24 saat oksijene maruz bırakılmıştır.

Metabolik profil oluşturmak. Üreticinin talimatlarına uygun olarak AN Micro-Plate™ teknolojisini (Biolog) kullanarak C. minuta için bir metabolik profil oluşturduk. Kısaca, kültürler, %5 (w/v) fibrini alınmış koyun kanı (Alliance Bio Expertise) ile takviye edilmiş Biolog Universal Anaerobe Agar (BUA; Biolog) üzerinde iki kez sürme işlemi gerçekleştirilmiştir. Anaerobik koşullar altında 37 °C’de 4 gün boyunca büyümenin gerçekleşmesine izin verilmiştir. Bakteriler swablanmış ve %65 geçirgenliğe ulaşılana kadar önceden indirgenmiş anaerobik aşılama sıvısına aktarılmıştır. Daha sonra bu bakteri süspansiyonunun 100 mL’si anaerobik koşullar altında AN MicroPlates™’in her kuyucuğu aşılamak için kullanılmıştır. Plakalar bir GENbox ve anaerobik kavanoz sistemi (bioMérieux) kullanarak anaerobik hidrojen içermeyen koşullar altında 37 °C’de 24 saat inkübe edilmiştir. Her kuyucuktaki renk kaymaları görsel olarak ve 590 nm’de (FLUOstar Omega, BMG Labtech) yapılan optik yoğunluk ölçümleriyle değerlendirilmiştir.

Ökaryotik hücrelerin kültürlenmesi. Avrupa Doğrulanmış Hücre Kültürleri Koleksiyonundan (ECACC; Sigma) insan kolon adenokarsinom hücre hattı HT-29’u elde edilmiştir. Hücreler, %10 (v/v) fetal sığır serumu (FBS; Gibco) ve %1 (v/v) penisilin/streptomisin (P/S; Sigma) ile takviye edilmiş McCoy’s 5A besiyerinde (Gibco) büyütülmüştür. Kültürler, %80 birleşmeye ulaşılana kadar %5 CO₂ koşulları altında 37°C’de tutulmuştur. American Type Tissue Collection’dan (ATCC®) Caco-2 hücre hattı elde edilmiştir ve glutaMAX™ (Gibco) %20 ısıyla inaktive edilmiş FBS ve %1 esansiyel olmayan amino asitler (Gibco) ile takviye edilmiş Dulbecco’nun modifiye Eagle’s besiyerinde (DMEM) tutulmuştur. Hücreler, %80 birleşmeye ulaşılana kadar %10 CO₂ koşulları altında 37°C’de tutulmuştur.

HT‑29 hücrelerinde immünomodülasyonun karakterize edilmesi. İlk olarak, HT-29 hücreleri 24 oyuklu plakalara (kuyucuk başına 3 x 10⁵ hücre) ekilmiştir. 24-48 saat sonra birleşme noktasına ulaşılmış ve tüm besiyeri %2 (v/v) FBS ile takviye edilmiş bir McCoy’s 5A besiyeri ile değiştirilmiştir. 24 saat sonra bu besiyeri %2 (v/v) FBS ve TNF-α (5 ng/mL, InvivoGen) ile takviye edilmiş McCoy’s 5A besiyeriyle değiştirilmiş ya (1) C.minuta’nın durağan fazında (%2, %10 veya %20 konsantrasyonlarda) kültür besiyerinden elde edilen süpernatant ya da (2) bakteriler (10, 50 veya 100 MOI’lerinde-bakterilerin ökaryotik hücrelere oranı) eklenmiştir. Kontrol olarak PBS gliserol kullanılmıştır. 6 saatlik birlikte-inkübasyondan sonra, hücre kültürlerinden süpernatanlar elde edilmiş ve interlökin-8 (IL-8) konsantrasyonları ölçülebilene kadar -80 °C’de saklanmıştır. Sonuncu işlem, bir İnsan IL-8 ELISA MAX Standart Seti (BioLegend) kullanılarak gerçekleştirilmiştir; absorbans bir FLUOstar® Omega mikroplaka okuyucusu (BMG Labtech) kullanılarak 450 nm’de ölçülmüştür.

Bir NF‑κB lusiferaz raportör vektörü ile transfekte edilmiş HT‑29 hücrelerinde immünomodülasyonu karakterize etme. Oyukbaşına 3 x 10⁵ hücre yoğunluğunda HT-29 hücreleri 24 oyuklu plakalarda X tremeGENE HP DNA Transfeksiyon Reaktifi (Roche) kullanılarak 200 ng pRelAluc ve 10 ng pRL-TK ile ters transfekte edilmiştir. Kısaca, transfeksiyon reaktifi:DNA kompleksi aşağıdaki gibi hazırlanmıştır: seruma ve antibiyotik içermeyen besiyerine uygun miktarda seyreltilmiş plazmit eklenmiştir (son hacim: 50 μL). Karışım nazikçe birleştirilmiş ve transfeksiyon reaktifi 3:1 oranında eklenmiştir. Transfeksiyon kompleksi nazikçe karıştırılmış, daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilmiştir. Daha sonra kompleks taze hücrelerle tohumlanmıştır (yani, hala süspansiyonda). Plakalar 24 saat inkübe edilmiş ve besiyeri daha sonra %2 (v/v) FBS ile takviye edilmiş McCoy’s 5A besiyeri ile değiştirilmiştir. 24 saatlik serum açlığından sonra besiyeri çıkarılmıştır ve %2 (v/v) FBS ve 5 ng/mL TNF-α (InvivoGen) ve ya (1) C. minuta’nın durağan fazı sırasında kültür ortamından elde edilen süpernatant (konsantrasyon: %10) yada (2) kontrol olarak bakteri ve kültür besiyeri (%10) ile takviye edilmiş McCoy’s 5A besiyeri ile değiştirilmiştir. 6 saatlik birlikte inkübasyondan sonra, hücreler iki kez soğuk 1X PBS ile yıkanmış ve nazikçe çalkalama koşulları altında oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 50 μL Pasif Lizis Tamponuna (Promega) maruz bırakarak çözünmüştür. Daha sonra, lizatlar mikrotüplere aktarılmıştır. Dual Luciferase® Reporter Assay System (Promega) büyük ölçüde üreticinin talimatlarına uygun olarak kullanılmış; birkaç küçük değişiklik yapılmıştır. Kısaca, 2 × 20 μL lizat numunesi beyaz 96 oyuklu plakalara aktarmış; daha sonra her oyuğa 50 μL LAR II solüsyonu eklenmiştir. İlk olarak, ateş böceği lusiferaz aktivitesinin seviyeleri belirlenmiştir. Ardından, 50 μL Stop & Glo® Reaktifi eklenmiş ve bir FLUOstar® Omega mikroplaka okuyucusu (BMG Labtech) kullanarak Renilla lusiferaz aktivitesinin seviyeleri belirlenmiştir. NF-KB aktivitesi, ateş böceği aktivitesinin Renilla aktivitesine oranı yoluyla ölçülmüştür.

Transepitelyal elektrik direncini ölçerek bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerin değerlendirilmesi. C. minuta’nın daha önce tarif edildiği gibi epitelyal bariyeri etkileyip etkilemediğini belirlemek için Caco-2 hücre hattı kullanılmıştır⁷⁴. Kısaca, Caco-2 hücreleri Transwell® içerisinde büyütülmüştür. Optimum transepitelyal elektrik direnci (TEER) değerlerine ulaşıldığında (REMS AutoSampler, World Precision Instruments), taze DMEM eklenmiştir. Daha sonra, hücrelerin apikal kısmına C. minuta muamelesi (MOI 40’ta bakteri) veya kontrol (PBS 1X) uygulanmıştır. Üç saat sonra, hücrelerin bazal kısımlarına 100 ng/mL TNF-α (Peprotech) eklenmiştir. TEER, uygulamadan hemen önce ve 24 saat sonra ölçülmüştür. Sonuçlar standartlaştırılmıştır (yani, bazal TEER’e göre).

Farelerde DNBS ile indüklenen kolit üzerindeki etkilerin değerlendirilmesi. C. minuta uygulamasının farelerde DNBS ile indüklenen kolit üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir. Janvier Laboratuvarı’ndan 7 haftalık 40 erkek C57BL/6J fare elde edilmiş ve onlar Fransız Ulusal Tarım, Gıda ve Çevre Araştırma Enstitüsü’nün (IERP Deneysel Birimi, INRAE) hayvan tesislerinde belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında korunmuştur. Beş kişilik kafeslere yerleştirilmişlerdir. Deneylerimiz, hayvan refahına ilişkin Avrupa Birliği mevzuatına uygun olarak gerçekleştirilmiş ve hayvan deneyleri (n°16744-201807061805486) üzerine yerel komitemiz COMETHEA  tarafından ve ARRIVE ile ilgili yönergelere uygun olarak onaylanmıştır. 7 günlük bir alışma periyodundan sonra, 40 fare 4 gruba ayrıldı (n = 10 fare/grup): vehikül kontrol grubu (iltihap yok; CTRL-vehikül), iltihaplı kontrol grubu (iltihap kaynaklı; DNBS-vehikül) , tedavi grubu (iltihap kaynaklı, C. minuta ile tedavi; DNBS-C. minuta) ve iltihap önleyici kontrol grubu (iltihap kaynaklı, 5-ASA ile tedavi; DNBS-5-ASA). İki hafta boyunca vehikül ve iltihaplı kontrol farelerine %16 (v/v) gliserol içeren oral dozda PBS (150 μL) verilmiş ve tedavi farelerine oral C. minuta dozu (10⁹ CFU/mL) verilmiştir. Anti-inflamatuar kontrol farelerine, DNBS enjeksiyonunun yapıldığı günden itibaren oral 5-ASA dozu (100 mg/kg; Sigma) verilmiştir. Gavajlar deneyin sonuna kadar günlük olarak gerçekleştirilmiştir. Daha sonra farelere %0.1 ketamin ve %0.06 ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu kullanarak anestezi uygulanmış; ardından onlara %30 etanol (w/v) içinde çözülmüş DNBS’nin (175 mg/kg) intrarektal enjeksiyonu verilmiştir. Vehikül kontrol grubu, %30 etanolün intrarektal enjeksiyonunu almıştır. Enjeksiyonlardan üç gün sonra farelere ötenazi uygulanmıştır. Deney sırasında vücut kütlesi günlük olarak ölçülmüştür. Kolon mikroskobik skorları (Ameho), makroskopik skorlar (Wallace) ve miyeloperoksidaz (MPO) aktivite seviyeleri daha önce tarif edildiği gibi karakterize edilmiştir⁷⁵.

Sıçanlarda TNBS ile indüklenen kolit üzerindeki etkilerin değerlendirilmesi. Sıçanlarda C. minuta uygulamasının TNBS ile indüklenen kolit üzerindeki etkileri değerlendirmiştir. Sprague Dawley sıçanlarını kullanılmış ve bu araştırma akredite bir sözleşmeli araştırma kuruluşunda (Intestinal Biotech Development, Lille) hükümet düzenlemelerine ve ARRIVE ile ilgili yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Sıçanlar 4 farklı gruba ayrılmıştır. Deneyin ilk 14 günü için, vehikül (CTRL-vehikül) ve iltihaplı kontrol sıçanları (TNBS-vehikül), %1 (v/v) gliserol içeren oral dozda PBS (150 μL) ile gavaj yoluyla beslenmiştir. Sıçanlara oral dozda C. minuta (10⁹ CFU/mL (TNBS-C. minuta) verilmiştir ve antiinflamatuar kontrol grubu olan 5-ASA granülleri sıçanların mamalarına karıştırılmıştır. Daha sonra, sıçanlara 2 saat boyunca anestezi uygulanmış ve koliti indüklemek için %40 etanol (w/v) içinde çözülmüş TNBS’nin (80 mg/kg) intrarektal enjeksiyonu uygulanmıştır. Sıçanlara enjeksiyondan dört gün sonra ötenazi yapılmış ve kolon kütlesinde olduğu gibi tedavi ve kontrollerin etkileri değerlendirilmiştir. Deney sırasında vücut kütlesi günlük olarak ölçülmüştür. Kolon mikroskobik ve makroskopik skorlar (sırasıyla Ameho ve Wallace) daha önce tanımlandığı gibi karakterize edilmiştir^40,76. Proinflamatuar sitokinler IL-1β ve IL-6 ve antiinflamatuar sitokin IL-10’un (eBioscience) seviyeleri değerlendirerek inflamasyon ölçülmüştür; kolondaki lipokalin-2 (LCN-2) (Cliniscience) seviyesi ELISA kullanılarak belirlenmiştir. Kısaca distal kolonun 1 cm’lik bir kısmı geri kazanılmış ve bir Precellys doku homojenleştirici kullanılarak proteaz inhibitörleri (Sigma) ve seramik boncuklar (çap: 1.4 ve 2.8 mm) içeren Tris-HCl tamponu içinde homojenleştirilmiştir (50 mg/mL). Örnekler 20 dakika santrifüj edilmiş ve süpernatant – 80 °C’de dondurulmuştur.

İstatistiksel analiz. Tüm sonuçlar, ortalama ± ortalamanın standart hatası (SEM) olarak ifade edilmiştir. GraphPad Prism (v. 8.2.1; GraphPad Yazılımı) kullanarak parametrik olmayan istatistiksel analizler-iki taraflı Mann Whitney U testleri gerçekleştirilmiştir. 0.05’lik bir alfa seviyesi kullanılmıştır.