Akkermansia muciniphila, in vitro erken yaşam koşullarında gelişmek için anne sütü oligosakkaritlerini kullanır

Akkermansia muciniphila, mukus degradasyonunda uzmanlaşmış ve insan sağlığı ile ilişkili, iyi çalışılmış bir anaerobik bakteridir. Mukus glikanlarının ve serbest anne sütü oligosakkaritlerinin (HMO’lar) yapısal benzerliği nedeniyle, A. muciniphila’nın anne sütü oligosakkaritlerini kullanma yeteneğini inceledik. A. muciniphila’nın anne sütü üzerinde büyüyebildiğini ve HMO’ları parçalayabildiğini bulduk. A. muciniphila’nın proteomunun analizleri, bakteri anne sütü üzerinde geliştirildiğinde anahtar glikan parçalayıcı enzimlerin eksprese edildiğini göstermiştir. Sonuçlarımız, HMO yapılarını 2′-FL, LNT, laktoz ve LNT2’yi parçalamak için anahtar glikan parçalayıcı enzimlerin (α-L-fukosidazlar, β-galaktosidazlar, ekso-α-sialidazlar ve β-asetilheksosaminidazlar) işlevselliğini göstermektedir. Konakçıdan türetilen glikan yapılarının hidrolizasyonu, A. muciniphila’nın diğer faydalı bakterilerle sintrofiyi teşvik etmesine ve bu şekilde bağırsakta mikrobiyal bir ekolojik ağa katkıda bulunmasına izin vermektedir. Bu nedenle, A. muciniphila’nın anne sütünü kullanma kapasitesi, yaşamın erken döneminde bağırsakta hayatta kalmasını ve erken yaşamda mukozal tabakanın kolonizasyonunu sağlayarak, daha sonraki yaşamda mukozal ve metabolik sağlığı garanti etmektedir. 

Akkermansia muciniphila, insan gastrointestinal (GI) sisteminin² mukus tabakasını kolonize olan Verrucomicrobia¹ filumuna ait Gram negatif bir anaerobtur. A. muciniphila, obezite^3,4, metabolik hastalıklar (Tip 2 diyabet)⁵ ve ayrıca bağırsak bozuklukları (inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) ve apandisit)^6-8 ile ters orantılı olduğu için sağlıklı bir mukozal tabaka ve metabolik durum ile ilişkilidir. Bu bağırsak bakterisi; yalnız enerji, karbon ve nitrojen kaynağı olarak müsini parçalama ve bu polimeri çoğunlukla asetat ve propiyonata dönüştürme konusunda olağanüstü bir kapasiteye sahiptir².

Akkermansia muciniphila, yetişkin ve bebek mikrobiyotasının ortak bir üyesidir⁹. Bebeğin A. muciniphila ile bağırsak kolonizasyonu, yetişkinlik döneminde sürekli artan bir bolluk ile yaşamın ilk ayından itibaren tespit edilmiştir^9,10. Ayrıca, A. muciniphila emziren annelerin meme dokusunda olduğu kadar anne sütünde de saptanmıştır^11-13. İlginç bir şekilde iki çalışmada, A. muciniphila’nın anne sütüyle beslenen bebeklerde mama ile beslenen bebeklere göre daha düşük bollukta bulunduğu bildirilmiştir^14,15. Yine de 98 İsveçli bebekle yapılan daha yakın tarihli bir çalışmada, A. muciniphila’nın bolluğu ve yaygınlığı 4 ve 12 ay arasındaki bebeklerde artmış ve doğum şekline veya beslenme türüne bağlı olarak önemli bir değişiklik göstermemiştir¹⁶.  Yaşamın erken dönemlerinde, anne sütü bebekler için genellikle tek besin ve diyet glikan kaynağıdır ve yenidoğanın gelişimi için en iyi besin olarak kabul edilmektedir¹⁷. Anne sütündeki glikanlar, anne sütü oligosakkaritleri (HMO’lar) olarak adlandırılır ve bebeklerin bağırsak mikrobiyota kompozisyonu üzerinde etkilere sahip olduğu kanıtlanmıştır¹⁸. Anne sütü 5-15 g/l HMO içermekte ve 100’ü başarıyla aydınlatılmış olan 200’den fazla farklı HMO yapısı bildirilmiştir^19-22. Bu HMO yapılarının varlığı ve miktarı kişiden kişiye değişmektedir ve annenin genetik Sekretor ve Lewis durumu ile ilgilidir²³. HMO’larda bulunan monosakkaritlerin ana yapı taşları D-glukoz (Glc), D-galaktoz (Gal), N-asetil-glukozamin (GlcNAc), L-fukoz (Fuc) ve N-asetilnöraminik asittir (sialik asit, Neu5Ac)²⁴ . Bu şekerler, hem lineer hem de dallı yapılarla sonuçlanan iyi tanımlanmış farklı glikozidik bağlantılar içeren bir dizi kompleks glikanlardan oluşmaktadır²⁵. Anne sütündeki oligosakaritlerin %70’i fukosile ve %30’u sialile edilmiştir^19,26. HMO’lar, bifidobakteriler gibi faydalı bakterilerin büyümesini teşvik ederek ve uyararak prebiyotik substratlar olarak işlev görebilmektedirler²⁷. Günümüzde bebek formüllerinin 2′-FL ve LNnT gibi HMO’larla desteklenmesi, bebek formülü bileşimini anne sütüne daha yakın hale getirmek için giderek daha fazla ilgi görmektedir²⁸. Ayrıca bu oligosakkarit moleküllerinin bazıları, reseptör analogları gibi hareket ederek ve bakteri yüzeyine bağlanarak patojenik bakterilerin kolonizasyonunu engellemektedir²⁴.

Şekil 1. Anne sütünde A. muciniphila gelişmesi. (a) Tek karbon ve nitrojen kaynağı olarak anne sütünde veya domuz müsininde A. muciniphila gelişmesi. Hata çubukları, üç biyolojik tekrar için qPCR’nin standart hatasını göstermektedir. A. muciniphila ile SCFA’lar üretimi (b) anne sütünde ve (c) müsin içinde. Hata çubukları, üç biyolojik kopyanın standart sapmasını göstermektedir.

HMO’lar ve müsin glikanlar arasındaki glikosidik yapının benzerliği, bazı bakterilerin neden hem anne sütü glikanlarını hem de konakçı mukozal glikanları (müsinler) kullanabildiğini açıklayabilmektedir^29,30. Müsinler, bağırsak epitel yüzeyini kaplayan mukus tabakasının ana yapısal bileşenleridir. Müsinlerin protein çekirdeği, başlıca N-asetilgalaktozamin, N-asetilglukozamin, fukoz, galaktoz ve sialik asit olmak üzere %80 karbonhidrattan oluşmaktadır^31,32. İnsan bağırsağındaki mukus tabakası, mikrobiyota için besin açısından zengin bir yaşam alanı sağlayan bir dış tabakaya ve epitel yüzeyine sıkıca bağlı ve neredeyse bakteri içermeyen bir iç tabakaya bölünmüştür³³. İnsan bağırsağında A. muciniphila, α-fukosidazlar, α-sialidazlar, β-galaktosidazlar, β-asetilheksosaminidazlar ve α-asetilglukosaminidazlar gibi müsin glikanların etkili metabolizması için büyük miktarda sülfataz ve glikozit hidrolaz (GH) kullanarak müsinleri parçalama konusunda olağanüstü bir kapasiteye sahiptir. 

Erken yaşamda bağırsakta A. muciniphila’nın varlığının, HMO’ları parçalamak için müsin parçalayıcı mekanizmaları kullanma yeteneğinin sonucu olduğunu varsayıyoruz. Erken yaşamda A. muciniphila’nın bağırsaktaki varlığı, mikrobiyal ekolojik ağ oluşumunu ve daha sonraki yaşam sağlığını garanti eden mukozal tabakanın sağlıklı mikrobiyal kolonizasyonunu artıracaktır. Bunu değerlendirmek için, A. muciniphila’nın anne sütü ve farklı HMO’larda gelişme yeteneğini test ettik. Daha sonra, A. muciniphila’nın parçalayabildiği HMO yapılarını ve parçalanmadan sorumlu enzimleri belirledik.

Sonuçlar

A.muciniphila, HMO’ların kullanımı yoluyla anne sütü üzerinde gelişir. A. muciniphila’nın anne sütü üzerinde inkübasyonu büyüme ile sonuçlanmıştır (Şekil 1a). Kültürlerin fermantasyon profili asetat, propiyonat ve süksinat üretimini (Şekil 1b,c) ve ayrıca anne sütünde ve HMO’larda zaten mevcut olan laktozun kullanılmasına bağlı olarak glikoz ve galaktoz salınımını göstermiştir (Şekil 2a). Üretilen kısa zincirli yağ asitleri (SCFA’lar) ve kullanılan şekerlerin miktarları Ek Tablo 2’de gösterilmektedir.

Şekil 2. A. muciniphila HMO degradasyonu. (a) Anne Sütü, (b) 2′-fukosillaktoz (2′-FL) ve (c) 3′-sialillaktoz (3′-SL). Hata çubukları, üç biyolojik tekrarın standart sapmasını temsil etmektedir.

Daha sonra, anne sütü üzerinde büyüme sırasında A. muciniphila tarafından hangi HMO yapılarının kullanıldığını araştırmaya çalıştık. HMO profilinde, nötr triozlar (2′ fukosillaktoz [2′-FL] ve 3-fukosillaktoz [3-FL]), tetraozlar (difukosillaktoz [DFL], lakto-N-tetraoz [LNT], lakto-N-neotetraoz)[LNnT]), pentaozlar (lakto-fukopentaoz I [LNFP I], lakto-fukopentaoz II [LNFP II], lakto-fukopentaoz III [LNFP III], lakto-fukopentaoz V [LNFP V]) ve asidik triozların (3′-sialillaktoz [3′-SL], 6′-sialillaktoz [6′-SL]) kullanımı gösterilmiştir (Şekil 3). Ölçülen tüm HMO’lar en az iki kat azalmıştır (Şekil 3). HMO profil analizi, A. muciniphila’nın anne sütünde bulunan neredeyse tamamen 2′-FL ve 3′-SL’yi (sırasıyla %99.65 ve %97.49) kullandığını ortaya koymuştur (Şekil 3). 

Şekil 3. %10 anne sütünde inkübe edilen A. muciniphila tarafından HMO yapılarının kullanılması. Her çubuğun üzerindeki sayılar, her bir HMO’nun bozulma yüzdesini göstermektedir. Hata çubukları, üç biyolojik tekrarın hata yayılımını temsil etmektedir.

Daha sonra, bu besin bileşenlerinin kendi başlarına A. muciniphila’nın büyümesini destekleyip desteklemediği test edilmiştir. A. muciniphila’nın saf 2′-FL veya 3′-SL (10 mM) ile inkübasyonu büyüme ile sonuçlanmış (Ek Şekil 1) ve hem 2′-FL hem de 3′-SL’den laktoz salınımı gösterilmiştir (Şekil 2b,c). Elde edilen laktoz ayrıca monosakkaritlerine (glikoz ve galaktoz) parçalanmıştır. 2′-FL üzerindeki büyüme, A. muciniphila tarafından fukoz metabolizmasının bir göstergesi olan 1,2-propanediol (5.95 ± 0.42 mM) üretimi ile sonuçlanmıştır. 3′-SL’den serbest kalan nöraminik asit, bakteri tarafından daha fazla katabolize edilmemiştir. Genel fermantasyon verimliliği, karbon dengesi hesaplanarak belirlenmiştir; karbon atomlarının 48 saatte 2′-FL ve 3′-SL’de geri kazanılması sırasıyla %86.58 ve %82.58’dir (Ek Tablo 3a). Ayrıca, üretilen kısa zincirli yağ asitlerinin (SCFA’lar) ve 2′-FL ve 3′-SL’de gelişen A. muciniphila’nın kullandığı şekerlerinin miktarları Ek Tablo 3b’de gösterilmiştir.

A. muciniphila, anne sütü üzerinde büyüme sırasında glikozit hidrolaz ekspresyonu sergiler. Anne sütü ve bileşenlerinin parçalanmasına katkıda bulunabilecek aktif enzimleri belirlemek için anne sütü üzerinde geliştirilen A. muciniphila kültürleri üzerinde proteomik analiz gerçekleştirdik. Anne sütünde gelişmeden sonra toplam 832 bakteri proteini tespit edilmiştir. Karbonhidrat metabolizmasına katıldığı tahmin edilen proteinler için proteom verilerini çıkardık ve bu sağlanan 109 protein ve bunların yarısından fazlası (62 protein) başlıca bu spesifik metabolik yola dahil olmuştur (Tablo 1). A. muciniphila, glikozit hidrolazları (GH’ler) kodlayan 58 proteine sahiptir. Sonuçlarımızda, HMO’larda bulunan en yaygın bağlantıları hedefleyen altı GH ailesine (GH2, GH20, GH29, GH33, GH35 ve GH95) ait 43 GH ve bu proteinlerin 19’unu tespit ettik. GH2 ailesine ait dört β-galaktosidaz, GH35 ailesinden iki β-galaktosidaz, GH 20 ailesinden yedi β-heksosaminidaz, GH29’den iki α-fukosidaz, GH95’den iki α-fukosidaz ve GH33’ten iki ekzo-alfa sialidaz tanımladık (Tablo 1). Böylece, A. muciniphila’nın fukosile HMO’lardan terminal α1-2/3/4 bağlantılı fukozu serbest bırakmak için fukosidazları kullandığını önerdik; 2′-FL (Fucα1-2Galβ1-4Glc), 3-FL (Galβ1-4Fucα1-3Glc), DFL (Fucα1-2Galβ1-4 Fuca1-3Glc), LNFPI (Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc), LNFP II (Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc), LNFP III (Galβ1-4Fucα1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) ve LNFP V (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Fucα1-3Glc). Ayrıca A. muciniphila, anne sütünde bulunan sialile glikanlardan 3′-SL (Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc) ve 6′-SL’den (Neu5Acα2- 6Galβ1-4Glc) α2-3 ve α2-6 bağlantılı sialik asidi serbest bırakabilen 2 sialidazı eksprese etmiştir. Ayrıca HMO’ların yapılarında bulunan terminal β1-3 ve β1-4 galaktoz kalıntılarının hidrolizi; LNT (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc), LNnT (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc), laktoz (Galβ1-4Glc), LNFP II, LNFP III ve LNFP V, anne sütünde gelişme sırasında A. muciniphila tarafından eksprese edilen β-galaktosidazların etkisinin sonucu olabilmektedir. Ayrıca A. muciniphila, glikan yapılarına bağlı terminal β1-3 ve β1-4N-asetilglukozamin (GlcNAc) salıvermekten sorumlu olan 7 β-heksosaminidazı da eksprese etmiştir. Ancak GlcNAc; çoğunlukla diğer monosakkaritler (galaktoz, fukoz, sialik asit) tarafından donatılmasından ziyade  genellikle HMO glikanlarında terminal şeker olarak bulunmaktadır. Böylece A. muciniphila, Lakto-N-biose (Galβ1-3GlcNAc), LNT2 (GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) gibi daha basit HMO’ları parçalamak için heksosaminidazlarını kullanabilmektedir. Ayrıca A. muciniphila, HMO’ların parçalanmasından serbest bırakılan monosakkaritleri metabolize etmek için gerekli enzimlerin bir kısmını eksprese etmiştir. A. muciniphila, örneğin serbest bırakılan fukozun 1,2-propanediol olarak faydalanılması için Amuc_1833 (L-fukoz taşıyıcı-fucP), Amuc_1832 (L-fukoz izomeraz-fucI), Amuc_1830 (L-fukulokinase-fucK) ve Amuc_1829 (sınıf II aldolaz-fucA)’yi kullanmaktadır. Ayrıca Amuc_0097 (ROK ailesi proteini), A. muciniphila tarafından, glikoliz yolunun ilk adımı sırasında glikozu α-D-glukoz-6-fosfata dönüştürmek için kullanılabiliyorken Amuc_0969 (Galactokinase), serbest galaktozu α-D-galaktoz-1-fosfata dönüştürerek galaktoz metabolizmasının ilk adımlarına katılmaktadır (Ek Tablo 4). Ancak A. muciniphila, proteom verilerinde bu enzimlerin hiçbir ifadesi gözlemlenmediğinden sialik asit kullanımı için gerekli tüm enzimlerden yoksundur. Bu veriler, A. muciniphila’nın, bileşenlerinin yanı sıra çok çeşitli HMO’ları kullanmak için enzimatik kapasiteye sahip olduğunu göstermektedir.

A.muciniphila HMO parçalayıcı enzimlerinin karakterizasyonu. Çalışmanın bir sonraki adımı, HMO parçalanmasında etkili olan A. muciniphila enzimlerinin karakterizasyonu ile ilgiliydi. Böylece laktoz ve HMO’ların; 2′-FL, LNT ve LNT2 (Tablo 1) glikosidik bağlarını hidrolize ettiği tahmin edilen proteomikler tarafından tanımlanan bir α-fukosidaz (Amuc_0010), iki β-galaktosidaz (Amuc_0771 ve Amuc_1686) ve iki β-asetilheksosaminidaz (Amuc_0369 ve Amuc_2136)  olan beş glikan parçalayıcı enzimi değerlendiridik. Rekombinant proteinlerin enzimatik aktivitesi ilk olarak sentetik substratlar kullanılarak değerlendirilmiştir (Tablo 2). Amuc_0010 ve Amuc_0369 5.6’da optimum pH gösterirken; Amuc_0771 ve Amuc_2136 ise 5.0’de optimum pH göstermiştir. Amuc_1686 için, pNP salım hızı (μΜ min^-1), test edilen tüm farklı pH değerleri için benzerdi (Ek Şekil 2). pH 5.0, bu enzim için optimal pH olarak seçilmiştir. Her enzimin optimum pH’ı ve 37 °C sıcaklığı, sentetik substratlar pNP-α-L-Fuc, pNPG ve GlcNAc-β-pNP’ye karşı bu proteinlerin kinetik parametrelerini değerlendirmek için kullanılmıştır (Tablo 2 ve Ek Şekil 3). α-L-fukozidaz (Amuc_0010), pNP-Fukoza karşı K_M 839 ± 46.72 μM göstermiştir. Her iki β-asetilheksosaminidaz (Amuc_0369 ve Amuc_2136), pNP-GlcNAc’den GlcNAc’yi ayırarak heksosaminidaz aktivitesi sergilemiştir. Amuc_0369 (322.37 ± 43.64 μM) için Amuc_2136’dan (714.55 ± 47.96 μM) daha düşük bir K_M gözlemlenmiştir. pNPG’den galaktozun ayrılması, β-galaktosidazlar (Amuc_0771 ve Amuc_1686) ile tespit edilmiştir. Amuc_0771 (2,599 ± 565.27 μΜ), Amuc_1686’dan (319.40 ± 259.30 μΜ) daha yüksek K_M göstermiştir. α-L-fukosidazın (Amuc_0100) 2′-FL’den (Fucα1-2Galβ1-4Glc) α1-2 bağlantılı fukozu ayırma yeteneği değerlendirilmiştir (Tablo 2 ve Ek Şekil 4). Enzim, 2′-FL’ye karşı pNP-Fuc’tan (2.27 x 10⁴ dk^-1 k_cat) yüksek bir KM ve daha düşük aktivite (152.08 dk^-1 k_cat) sergilemiştir. β-asetilheksosaminidazların (Amuc_0369 ve Amuc_2136) HMO’lar, LNT (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) ve LNT2 (GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) üzerindeki aktivitesi de değerlendirilmiştir. Substrat ve ürün spesifikliği, HPAEC-PAD ile izlenmiştir. Her iki enzim için, LNT varlığında hiçbir GlcNAc serbestleşmesi gözlemlenmemiş, oysa her iki A. muciniphila β-asetilheksosaminidaz, LNT2 ile sonuçlanan terminal GlcNAc’yi laktozdan ayırabilmiştir.  Amuc_0369, LNT2’ye karşı k_cat 1.42 × 10⁴ dk⁻¹ ve K_M 3.980 ± 210.30 μM sergilemiştir. Amuc_2136 Amuc_0369’dan (2,435.82 ± 289.51 μM K_M) daha yüksek substrat affinitesi göstermiş, ancak katalitik aktivitede (1.45 × 10⁴ dk^-1 k_cat) önemli bir fark bulunmamıştır. β-galaktosidazlar (Amuc_0771 ve Amuc_1686); HMO, LNT (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) ve laktozdan (Galβ1-4Glc) galaktosidik bağlantıları parçalama yetenekleri açısından test edilmiştir. Amuc_0771 LNT’ye (β1-3) karşı bir k_cat 4.42 × 10³ dk^-1 ve bir K_M 1,223 ± 171.7 μM göstermiştir (Tablo 2). Ayrıca Amuc_0771, gece boyunca 2,000 μΜ laktoz içinde inkübe edildiğinde 711 μΜ glikoz ve 936 μΜ galaktozu serbest bırakmıştır (Ek Şekil 5). Ancak laktozdaki reaksiyon yavaştı ve bu nedenle Amuc_0771’in kinetiğini değerlendiremedik. Enzim, hem β1-3 hem de β1-4 glikozidik bağlantıları için parçalama kapasitesi sergilemiştir, ancak β1-3 bağlantılarına karşı daha yüksek substrat özgüllüğüne sahipti. Diğer β-galaktosidaz (Amuc_1686), LNT veya laktoza karşı hiçbir enzimatik aktivite göstermemiştir. IPTG ile indüklenen pCDF1-b boş vektörünü barındıran E. coli BL21 Rosetta suşu negatif kontrol olarak kullanılmıştır ve bu substratlara karşı hiçbir aktivite göstermeyen 2 mM LNT, 2′-FL, laktoz ve 5 mM LNT2’de gece boyunca inkübe edilmiştir (Ek Şekil 7). 

Tablo 1. Karşılık gelen KEGG tanımlayıcısı (KO ID) ile karbonhidrat metabolizmasında yer alan A. muciniphila enzimlerinin bolluğu. Log10 dönüştürülmüş LFQ değerlerinin ortalaması gösterilmektedir. Renklendirme, en boldan (kırmızı) orta bolluğa (turuncu) ve en az bolluğa (yeşil) kadar dayanmaktadır.

Tablo 2. Sentetik substratlar ve HMO’lar ile α-L-fukosidaz (Amuc_0010), β-heksosaminidazlar (Amuc_0369 ve Amuc_2136) ve β-galaktosidazların (Amuc_0771 ve Amuc_1686) kinetik parametreleri.

A. muciniphila, anne sütü oligosakkaritlerini tüketmek için mukus kullanım enzimlerini eksprese etmektedir. Akkermansia muciniphila, mukus glikan parçalamasında ustadır ve bu çalışmada A. muciniphila’nın anne sütü glikanlarını da kullanabildiğini gösterdik. Böylece enzimatik kapasitenin farklı çevresel koşullara adapte olup olmadığını araştırdık. Sonuç olarak, anne sütü üzerinde gelişen A. muciniphila ile müsin üzerinde gelişen A. muciniphila  arasındaki protein ekspresyon profilini karşılaştırdık.  

İlk olarak, anne sütü veya müsin içinde gelişen kültürlerden α-fukosidaz, β-galaktosidaz ve sialidaz aktivitelerini ölçerek A. muciniphila hücre lizatlarının aktivitesini test ettik. Müsin ve anne sütü kültürlerinden elde edilen lizatlar, sentetik substratlarla inkübe edilmiş ve her ikisi de fukosidaz, β-galaktosidaz ve sialidaz aktivitesi göstermiştir. Anne sütü hücre lizatları, müsin lizatlarından önemli ölçüde daha yüksek β-galaktosidaz ve sialidaz aktivitesi göstermiştir (Şekil 4a,b). Fukosidaz aktivitesi hem anne sütü hem de müsin için benzerdi (Şekil 4c). Hücre lizatları ayrıca laktoz veya 2′-FL ile de inkübe edilmiştir. 0. ve 20. saatlerde numuneler alınmış ve HPAEC-PAD ile analiz edilmiştir. Hem anne sütü hem de müsin üzerinde gelişen A. muciniphila’dan elde edilen lizatlar; laktozun kurucu monosakaritlerine (glikoz ve galaktoz) kısmi parçalanmasına ve 2′-FL’nin laktoz, glikoz, galaktoz ve fukoza kısmi parçalanmasını göstermiştir (Ek Şekil 6a-d).

İkinci olarak karşılaştırmalı bir proteom çalışması, anne sütü veya mukus koşullarında eksprese edilen A. muciniphila enzimlerini tanımlamıştır. Hem anne sütünde hemde müsinde toplam 832 protein tespit edilmiştir. 46 protein anne sütünde önemli ölçüde daha fazla bulunurken (p değeri <0.05), müsin durumunda 219 protein daha bol bulunmuştur (Ek Şekil 7). Proteinlerin geri kalanı, iki koşul arasında benzer miktarlarda ifade edilmiştir. 36’sı (% 33) çevresel koşullardan önemli ölçüde etkilenmekle beraber çoğunluğu (% 67) anne sütü ve müsin içinde benzer miktarlarda ifade edildiği gibi (Tablo 3) karbonhidrat metabolik prosesine dahil olan 108 protein belirledik (Ek Tablo 5 ve 6). Mukus glikan parçalama enzimlerine odaklanıldığında, A. muciniphila proteomundaki 61 açıklamalı enzimden 42’si hem süt hem de müsin koşullarında tespit edilmiştir (Tablo 3). Çoğunluk (%64) her iki durumda da benzer miktarlarda ifade edilmiştir. Üç protein (sülfataz aktivitesini kodlayan Amuc_1755 ve Amuc_1033, tripsin benzeri protein serin proteazını kodlayan Amuc_0670) anne sütünde önemli ölçüde daha fazlaydı. 12 protein (Amuc_1631—Karboksil terminal proteaz, Amuc_1220—α-N-asetilglukozaminidaz, Amuc_0451—Sülfataz, Amuc_0824—Glikozit Hidrolaz Ailesi 2, Amuc_1008—Glikozit Hidrolaz Ailesi 31, Amuc_1835—Exo-α-sialidase, Amuc_1182—Sülfataz, Amuc_0010—α-L-fukosidaz, Amuc_0369—β-N-asetilheksosaminidaz, Amuc_1187—α-galaktosidaz, Amuc_1924—β-N-asetilheksosaminidaz ve Amuc_1815—β-N-asetilheksosaminidaz) müsin durumunda daha bol bulunmuştur. Glikan parçalayıcı enzimlerin çoğunluğunun glikozit hidrolazlar (GH) ailesine ait karbonhidrat aktif enzimler olduğu bulunmuştur (Tablo 3). Son olarak anne sütü koşulları, bir dış zar proteini olarak karakterize edilen pili ile ilişkili proteinin (Amuc_1100) daha yüksek bir ekspresyonunu göstermiştir³⁵. Pili gen kümesinin (Amuc_1098 – Amuc_1102) tüm proteinleri, anne sütünde daha yüksek seviyelerde (Amuc_1099, Amuc_1100, Amuc_1101) eksprese edilmesine rağmen Amuc_1098 müsin üzerinde daha boldur (p-değeri < 0.05). Sonuçlar, A. muciniphila’nın anne sütündekiler ve mukus tabakasındakiler gibi kompleks konakçı kaynaklı glikan yapıları üzerinde gelişmek için oldukça adapte olmuş bir yaşam tarzına sahip olduğunu göstermektedir; burada organizma tarafından her iki substratı da parçalamak için benzer enzimler kullanılmaktadır.  

Tartışma

Bu çalışma, A. muciniphila’nın bir dizi HMO parçalayıcı enzimin ekspresyonu sayesinde anne sütü üzerinde büyüyebileceğini göstermektedir. A. muciniphila tarafından anne sütü fermantasyonu, fukosile ve sialile HMO’ların parçalanmasıyla sonuçlanmıştır (Şekil 3). A. muciniphila GH29 α-fucosidase’in (Amuc_0010) α1-2-bağlı fukozu galaktoza parçalayabildiğini gösterdik. Ancak 2′-FL ile inkübasyon sırasında elde edilen yüksek K_M değeri bu substratın Amuc_0010 için tercih edilen substratlardan biri olmayabileceğini göstermiştir. Mukustaki fukoz çoğunlukla α1-6 yoluyla O-glikanlardaki indirgeyici terminal GlcNAc³⁰‘a bağlı bulunmaktadır, A. muciniphila’dan elde edilen bu enzimin HMO’larda var olan glikozidik bağlantılar üzerine mukus glikan yapılarını tercih edebileceğini göstermektedir. HMO içeriği belirli glikosiltransferazların ekspresyonuna bağlı olarak kişiden kişiye farklılık göstermektedir. Örneğin terminal α1-2 fukosillenmiş HMO’ların varlığı, insanlarda sekretör gen tarafından kodlanan fonksiyonel bir α1-2 fukosiltransferaz (FUT2) gerektirmektedir^36,37. İlginç bir şekilde, FUT2 salgılayan annelerin salgı yapmayan annelere göre sezaryenle doğan bebeklerinde A. muciniphila’nın daha fazla olduğu bildirilmiştir³⁸. Bu çalışmada, A. muciniphila’nın anne sütünden gelen fukozu ve 2′-FL ile desteklenmiş bazal besiyerini enerji kaynağı olarak kullanabileceğini ve bunun sonucunda 1,2-propanediol üretebildiğini gösterdik. Bu, A. muciniphila’nın müsinden salınan fukozu kullanma yeteneği ile uyumludur. 1,2-propanediolün serbest bırakılması, önceki çalışmalarda 1,2-propanediolün gastrointestinal sistemdeki diğer bakteriler tarafından kullanıldığını gösterdiğinden, bağırsakta çapraz beslemeye yol açabilir^39-42. Örneğin, Eubacterium hallii ve Lactobacillus reuteri, propiyonat üretmek için fukoz ve ramnozun fermentasyonundan türetilen 1,2-propanediol’ü kullanabilmiştir^39,40. Bu şekilde A. muciniphila’nın süt ve mukus parçalama yeteneği, erken yaşam bağırsağında ve bağırsakta erken yaşam mukozal ortamında mikrobiyal ağ oluşumunu destekleyecektir.

Şekil 4. A. muciniphila hücre lizatlarının enzimatik aktivitesi. Hücre lizatlarındaki (a) β-galaktosidazlar, (b) sialidazlar ve (c) α-fukosidazların aktivitesi sırasıyla 2.5 mM oNPG/pNPG, 2.5 mM MU-NA ve 0.5 mM pNPFuc ile test edilmiştir. Bir birim (U), dakikada 1 µmol substratı dönüştüren enzim miktarıdır.

A.muciniphila, 3′-sialillaktozu laktoz ve nöraminik aside parçalayabilen sialidazları kodlamaktadır. A. muciniphila’nın sialile mukus-glikanlara karşı aktivitesi daha önce değerlendirilmiştir⁴³. Proteomik veri setimizde iki ekzo-α-sialidazın (Amuc_0625 ve Amuc_1835) var olduğunu bulduk. Bu nedenle, sialile HMO’lardan 3′-SL ve 6′-SL⁴⁴‘den α2-3 ve α2-6-bağlı siyalik asidin salınmasının sialidazların aktivitelerinin sonucu olduğu düşünülmüştür. 3′-SL’nin parçalanmasıyla ortaya çıkan sialik asit, A. muciniphila tarafından daha fazla kullanılamaz. Bunun nedeni, diğer mikroorganizmalarda sialik asit kullanımı için gerekli olduğu tanımlanan Nan kümesinden (NanA/K/E) yoksun olması olabilmektedir⁴⁵. Hem anne sütü hem de müsin, terminal sialil grupları açısından zengindir. A. muciniphila’nın sialidaz aktivitesi sialik asit salınımına olanak tanımaktadır, ancak büyük olasılıkla A. muciniphila’nın ulaşılması zor şekerlere ulaşmak için sialidaz aktivitesini kullandığı görülmektedir. Aynı zamanda salınan sialik asit, A. muciniphila’nın kendisinden ziyade topluluk üyeleri için substrat görevi görebilir. Bu, A. muciniphila’nın bebek bağırsağında sialil gruplarını kullanabilen bakterilerin gelişmesini uyaran ve böylece çeşitliliği artıran bir mikrobiyal ağ oluşumunda kilit bir rol oynadığını ima etmektedir. Örneğin Bifidobacterium breve’nin gelişmesi, Bifidobacterium bifidum^46,47 tarafından bağırsakta sialil-oligosakkaritlerin parçalanmasından serbest kalan sialik asit tarafından desteklenmektedir. Ayrıca insanların sindirim sisteminde bulunan Ruminococcus gnavus ATCC 29149, sialik asit tüketimi için bütün bir Nan kümesini kodlamaktadır⁴⁸. Bacteroides fragilis’in bağırsakta salınan sialik asidi alternatif bir yol (nanLET)⁴⁹ aracılığla metabolize edebildiği de bildirilmiştir. A. muciniphila’nın çapraz besleme özelliklerini daha da desteklemek için, daha önce A. muciniphila’nın müsin üzerinde geliştiğinde bütirat üreticisi Anaerostipes caccae’nin mevcudiyeti ile uyarıldığı gözlemlenmiştir. Aslında A. muciniphila A. caccae ile birlikte kültürlendiğinde; GalNAc, GlcNAc, mannoz, galaktoz, fukoz ve sialik asit gibi monomerik şekerlerden oluşan oligosakarit zincirlerinin parçalanmasında rol oynayabilen müsin parçalayıcı genleri yukarı doğru regüle etmektedir⁵⁰. 

Tablo 3. A. muciniphila’nın sakarolitik enzimleri. Gri renkli yer etiketleri, karşılık gelen CAZy Ailesi gruplarıyla müsin parçalanmasında olduğu tahmin edilen enzimleri göstermektedir. Pozitif değerler (Log10 Kat değişimi) anne sütünde müsin durumuna göre daha yüksek bolluğu göstermektedir. 0,05’ten küçük P değerleri açık mavi renkle gösterilmiştir. 

Proteom verilerinde, anne sütü ve müsin kültürleri arasında benzer ekspresyon gösteren A. muciniphila’nın iki β-galaktosidazını (Amuc_0771, Amuc_1686) tanımladık. Rekombinant olarak eksprese edilen protein Amuc_0771, galaktoz ve glikoz salarak laktoz üzerinde aktivite sergilemiştir. Ancak reaksiyonun hidroliz hızı yavaştı ve bu enzimin laktoz üzerindeki kinetiğini belirleyemedik. Bu bulgu Amuc_0771’in β1-4 bağlantılı galaktozdan glukoza (laktoz) ve β1-4 bağlantılı galaktozdan N-asetil-D-glukozamine (LacNAc) karşı düşük nispi hidrolitik aktivite sergilediğini gözlemleyen Kosciow vd.’ninki ile tutarlıdır⁵¹.  Guo vd., yakın zamanda bir A. muciniphila GH35 β-galaktosidaz, Am0874’ün enzimatik aktivitesini karakterize etmiştir. Bu çalışmada, A. muciniphila’nın başka herhangi bir ortak genom veya proteom veritabanında bulunmayan genlerini açıklamak için farklı bir araç kullanılmıştır (ncbi.nlm.nih.gov, genome.jp/keg, uniport.org,). Her iki β-galaktosidaz NCBI’den protein dizilerini sıraladığımızda, Amuc_0771 ve Am0874 arasında %100 bir benzerlik bulduk. Guo vd.’nın verilerine dayanarak, bu enzimin sentetik substratlar ve N-glikanlardaki glikozidik bağları hidrolize edebildiğini doğrulayabiliriz. Enzimin β1-4’e bağlı galaktozdan β1-3 ve β1-6’yı parçalamada daha yüksek verimlilik gösterdiğine dikkat çekmişlerdir. İlginç bir şekilde, Am0874’ün β1-3-konfigürasyonu GalNAc’de bağlanmış galaktoza kıyasla galaktoz β1-4-konfigürasyonunda GlcNAc’a bağlandığında daha düşük parçalama kapasitesine sahip olduğunu bulmuşlardır⁵². Sonuçlarımızda bu β-galaktosidaz (Amuc_0771), β1-3-bağlı galaktoza (LNT) karşı β1-4 konfigürasyonundan (laktoz) daha yüksek hidroliz sergilemiştir. Araştırdığımız diğer β-galaktosidaz (Amuc_1686), LNT veya laktoza karşı hidrolize etme kapasitesi göstermemiştir. Amuc_1686’nın aktivitesi, enzimin laktoza karşı da hiçbir aktivite göstermediğinin bildirildiği, ancak Galacto-N-biose (Galβ1-3GalNAc)’e göre tercih gösterdiğinin bildirildiği başka bir çalışmada karakterize edilmiştir⁵³. Aynı çalışmada, Amuc_1686’nın sadece β1-3-bağlı galaktozu GalNAc’a parçalayabildiğinden ve β1-3-bağlı galaktozu GlcNAc’a parçalayamadığından bahsedilmişdir. Onların bulguları, Amuc_1686’nın deneylerimizde β1-3 bağlantılı galaktozun GlcNAc’a (LNT) karşı niçin aktif olmadığını açıklayabilir. A. muciniphila’nın β-galaktosidazları, sütün glikan yapılarına bağlı terminal galaktozun serbest bırakılmasından sorumludur. Serbest galaktoz, bir galaktokinazın (Amuc_0969) etkisi ile daha da tüketilmektedir. Şaşırtıcı bir şekilde proteom verilerinin daha yakından analizinde, A. muciniphila’nın Amuc_0969’u Amuc_0097’den daha yüksek miktarlarda ürettiği vurgulanmıştır; bu durum galaktozun glukoza kıyasla A. muciniphila tarafından kullanılmaya devam ettiğini göstermektedir (Ek Tablo 4).

Mukustaki glikoproteinlerin yokluğunda A. muciniphila, GlcNAc için gerekli bir ihtiyaca sahiptir⁵⁴. Anne sütü üzerinde gelişme durumunda GlcNAc, β-asetilheksosaminidazlar tarafından serbest bırakılabilir. Wang vd., yakın zamanda GlcNAc terminalini N- ve O-glikanlardan ayırabilen ve bunun glikozit hidrolazlar olarak ekzo-aktivitesini doğrulayan iki A. muciniphila GH20 β-asetilheksosaminidazı (Am2301 ve Am2446) tanımlamışlardır⁵⁵. Saflaştırılmış β-asetilheksosaminidazlar (Amuc_0369 ve Amuc_2136) üzerindeki biyokimyasal deneyimiz, her iki enzimin de sadece GlcNAc’ı laktoza (LNT2) bağlı terminal β1-3’ü hidrolize edebildiğini ve bu da HMO yapısının (LNT) içinde yer alan GlcNAc’nin değil, laktoz molekülünün serbest bırakılmasıyla sonuçlandığını ortaya çıkarmıştır.

Anne sütü üzerinde gelişen A.muciniphila, süksinatın (~ 10 mM) önemli miktarda üretimine yol açmıştır. A. muciniphila, daha önce tanımlandığı gibi, bağırsakta propiyonat üretmek için süksinat yolunu kullanmaktadır⁵⁶. Son zamanlarda, A. muciniphila’nın süksinatı propiyonata dönüştürmek için Metilmalonil-CoA sentazın bir kofaktörü olarak B₁₂ vitamininin varlığına bağlı olduğu gösterilmiştir^50,57. Anne sütünde geliştirilen A. muciniphila, süksinatı propiyonata başarıyla dönüştürmek için gerekli tüm enzimleri eksprese etmektedir (Metilmalonil-CoA mutaz; Amuc_1984, Amuc_1983 ve Metilmalonil-CoA epimeraz; Amuc_0200). Anne sütünde B₁₂ vitamininin haptokorrine sıkı bir şekilde bağlı olabileceği ve konsantrasyonun annenin diyetine özellikle hayvansal ürünlerin alımına bağlı olarak değiştiği tanımlanmaktadır⁵⁸. Deneyimizde süksinatın anne sütünde propiyonata dönüştürülmemesinin bir açıklaması, A. muciniphila’nın anne sütünde bulunan B₁₂‘yi kullanmada etkili olmadığı olabilmektedir.

Anne sütü üzerinde gelişen Akkermansia muciniphila, pili proteininin (Amuc_1100) önemli ölçüde daha yüksek bolluğunu göstermektedir (p-değeri = 0.02, 1.29 kat değişim)⁵⁹. Bu dış zar pili benzeri protein, bağışıklık düzenlemesinde ve trans-epitelyal direncin arttırılmasında önemli bir rol oynamaktadır. Son zamanlarda Amuc_1100’ün, farelerde bağırsak bariyerini iyileştirebildiği ve yüksek yağ içeren diyete bağlı obeziteyi sınırlayabildiği gösterilmiştir⁶⁰. Bu nedenle, bebek bağırsağında bu proteinin ekspresyonu, erken yaşamda bağışıklık olgunlaşmasına ve bağırsak sağlığına da katkıda bulunabilmektedir.

İlginç bir şekilde proteom analizi, sülfat ester hidrolazlar olarak işlev gören yedi sülfatazın yüksek bolluğunu göstermiştir. Bu eksprese edilen sülfatazlardan dördü (Amuc_0451, Amuc_1033, Amuc_1182, Amuc_1755) anne sütünde önemli ölçüde daha yüksek eksprese edilmiştir. HMO’ların, müsinin O-glikanlarında olduğu gibi glikan yapılarına bağlı sülfat kalıntılarına sahip olabileceği şimdiye kadar bildirilmemiştir. Ancak anne sütünün 100 µmol/L’den fazla sülfat esteri içerebileceği açıklanmıştır⁶¹. Bu sülfat esterleri, glikozaminoglikanların (GAG’ler) bir parçasıdır. GAG’ler anne sütünde (416 mg/L) bulunmakta ve şeker biriminin bir N-asetilheksozaminden (GalNAc veya GlcNAc) oluştuğu disakkaridik birimlerden oluşan yüksek oranda sülfatlanmış lineer polisakaritlerdir⁶². Anne sütünde en bol bulunan GAG’lar kondroitin sülfat (CS) (231 mg/L) ve heparindir (Hep) (173 mg/L). Bu nedenle A. muciniphila’nın sülfatazlarını; anne sütü glikozaminoglikanlarında bulunan sülfürik esterlerin hidrolizi için kullanması mümkündür. 

Bu çalışmada, A. muciniphila’nın anne sütü üzerinde gelişebildiği ve glikan parçalayıcı enzimlerini kullanarak HMO’ları parçalayabildiği gösterilmiştir. Bu glikan parçalayıcı enzimler, HMO’ları hücre dışında mono ve disakkaritlere hidrolize etmekte ve daha sonra serbest bırakılan şekerler taşıyıcılar tarafından hücreye aktarılmaktadır³⁴. Bu bulgular, A. muciniphila tarafından; 2′-fukosillaktoz, 3′-sialillaktoz, lakto-N-tetraoz, lakto-N-trioz II ve laktozun kullanımı için bir model önermemize olanak sağlamaktadır (Şekil 5). Çalışmanın sonuçları, A. muciniphila’nın anne sütünden veya bebek mamalarından gelen oligosakkaritleri tüketerek erken yaşam ortamında hayatta kalabildiğini göstermektedir.

Şekil 5. A. muciniphila tarafından saf 2′-fukosillaktoz, 3′-sialillaktoz, lakto-N-tetraoz, lakto-N-trioz II ve laktozun metabolizması için önerilen yolun şematik gösterimi. Yeşil renkli proteinler α-fukosidazları, turuncu renk sialidazları, kırmızı renk β-galaktosidazları ve mavi renk β-N-asetilheksosaminidazları temsil etmektedir. fucP l-fukoz taşıyıcı, T varsayılan substrat taşıyıcı.

Bu, A. muciniphila’nın doğal nişine, dış mukoza tabakasına ulaşmadan önce ilk erken yaşam kolonizasyonu sırasında faydalı etkiler sağlayabilmektedir. Ayrıca, HMO’ların A. muciniphila tarafından yetersiz parçalanması, daha sonra diğer faydalı bakteriler tarafından erişilebilir hale gelen daha basit glikan yapılarını ve metabolitlerini serbest bırakmaktadır. Süt ortamı ayrıca bebek bağışıklık sistemine fayda sağlayabilecek olan A. muciniphila dış zar proteini Amuc_1100’ün ekspresyonunu da aktive etmiştir^63,64. Anne sütü erken yaşam kolonizasyonunu kolaylaştıran bebeğin bağırsağına anne sütünün mikrobiyotasını taşımaktadır. Glikan parçalayıcı mikroplarla yaşamın başlangıcından itibaren sağlıklı bir bağırsak mikrobiyotasının geliştirilmesi, bağışıklık sisteminin gelişimine rehberlik ederek ve patojenlere karşı koruma sağlayarak daha sonraki yaşamda sağlıkla ilişkilendirilebilmektedir^65,66. Bu nedenle A. muciniphila sağlıklı mikrobiyota ve bağışıklık gelişimine rehberlik eden erken yaşamın anahtar üyelerinden biri olabilir. 

Materyal ve Metodlar

Bakteriyel büyüme koşulları. Akkermansia muciniphila Muc^T (ATCC BAA-835), daha önce tanımlandığı gibi bazal ortamda geliştirilmiştir². Ortam, etanol çöktürmesi ile saflaştırılan domuz mide müsini (%0.5 w/v Tip III, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD), anne sütü (%10 v/v), 2′-fukosillaktoz (2′-FL, 10 mM, saflık > %90) veya 3′-sialillaktoz (3′-SL, 10 mM, saflık > %90) ile desteklenmiştir⁶⁷. HMO’ları (yani 2′-FL ve 3′SL) içeren büyüme koşulları, A. muciniphila (Sigma-Aldrich) için nitrojen kaynağı olarak 25 mM N-asetilglukozamin (GlcNAc) ile desteklenmiştir. Anne sütü ve HMO içeren şişelere ayrıca L-Proline ve L-Threonin (Sigma-Aldrich) (6 g/L) ilave edilmiştir. Tüm anaerobik şişelere, daha önce tanımlandığı gibi %1 v/v CaCl₂ ve vitamin karışımı ilave edilmiştir⁶⁸. Anne sütü sağlıklı bir donörden (doğumdan yaklaşık 3-6 ay sonra) steril koşullar altında toplanmış ve kullanılıncaya kadar -20 °C’de saklanmıştır. İnkübasyonlar, 182 kPa (1.5 atm) N₂/CO₂T gaz fazı tarafından sağlanan anaerobik koşullar altında 37 °C’de bütil lastik tıpalarla kapatılmış serum şişelerinde tamamlanmıştır. Müsin üzerinde bakteri üremesi 600 nm’de optik yoğunluk ve nicel Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) ile ölçülmüştür. Anne sütünde gelişen A. muciniphila kültürlerinin optik yoğunluğu sütün yüksek bulanıklığı nedeniyle belirlenememiştir. Bu nedenle bakteri sayıları yalnızca qPCR ile ölçülmüştür.

Nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR). Anne sütü ve müsin içindeki A. muciniphila’nın bolluğu daha önce tanımlandığı gibi qPCR ile belirlenmiştir¹⁰. Hücreler (1 mL) 21,000 x g’de 15 dakika boyunca toplanmıştır. DNA ekstraksiyonları MasterPure™ Gram Positive DNA Purification Kit (Epicentre, Lucigen, ABD) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. DNA konsantrasyonları florometrik olarak ölçülmüş (Qubit dsDNA BR testi, Invitrogen) ve qPCR’de şablon olarak kullanılmadan önce 1 ng/μL’ye ayarlanmıştır. A. muciniphila’nın 16S rRNA genini hedefleyen primerler (AM1 5′-CAG CAC GTG AAG GTG GGG AC-3′ ve AM2 5′-CCT TGC GGT TGG CTT CAG AT-3′; 327 bp¹⁰) miktar tayini için kullanılmıştır. 10⁰ ile 10⁸ gen kopyası/μL ‘den dokuz standart konsantrasyonla standart bir eğri hazırlanmıştır. qPCR; iQ SYBR green supermix (Bio-Rad, ABD) ile 384 oyuklu plakalarda 500 nM’de primerlerle hazırlanan toplam 10 μL hacimde üç kopya halinde gerçekleştirilmiş ve oyuklar optik sızdırmazlık bandı ile kapatılmıştır. Amplifikasyon: 10 dakika boyunca 95 °C’lik bir döngü; 15 sn için 95 °C, 20 sn için 60°C ve 30 sn için 72 °C’lik 40 döngü; 1 dakika için 95 °C’lik bir döngü; ve erime eğrisi verilerini elde etmek için sıcaklığın 60’tan 95 °C’ye (5 saniyede 0,5 °C’de) kademeli olarak artması sağlanarak bir iCycler (Bio-rad) ile gerçekleştirilmiştir. Veriler Bio-Rad CFX Manager 3.0 kullanılarak analiz edilmiştir. Kopya numarası, DNA konsantrasyonu ve A. muciniphila’nın genomunda kodlanan 16S rRNA genlerinin sayısı için doğrulanmıştır. 

Anne sütü oligosakkarit ekstraksiyonu. HMO’lar, daha önce tanımlandığı gibi %10 v/v anne sütü kültürlerinde geliştirilen 1 mL A. muciniphila alikuotlarından geri kazanılmıştır⁶⁹. 0.01 mmol/L’lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için, pipetleme hatasını en aza indirmek için numune başına 10 μL hacimde bir iç standart 1,5-α-L-arabinopentaose (Megazyme, İrlanda) eklenmiştir. Çözelti, ultra saf su ile 1:1 oranında seyreltilmiş ve 4 °C’de 15 dakika 4,000 x g’de santrifüjlenmiştir. Süpernatant, 0.2 μm şırınga filtresinden süzülmüş, ardından önceden yıkanmış bir ultra filtre (Amicon Ultra 0.5 Ultracel Membrane 3 kDa cihazı, Merck Milipore, ABD) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca 14,000 x g’de santrifüjlenmiştir. Son olarak süzüntü vortekslenmiş ve -20 °C’de saklanmıştır.

Elektrosprey iyonizasyon sıvı kromatografisi kütle spektrometrisi (LC‑ESI‑MS²) analizi. HMO’lar tanımlanmış ve LC-ESI-MS^{2 69} ile miktarları belirlenmiştir. Bu yöntem, farklı HMO yapılarının özellikle monosakkarit dizileri, glikozidik bağları ve moleküler konformasyonlarının araştırılmasına olanak tanımaktadır. Böylece, Lakto-N-fukopentaoz (LNFP) I, II, III ve V gibi HMO’ların izobarik izomerleri, Mank vd. tarafından tanımlandığı gibi ayırt edilebilmektedir. Uyarlamaya ikinci yaklaşımı kullandık. Mikro LC-ESI-MS² analizi, bir 3,200 Qtrap kütle spektrometresine (ABSciex, ABD) bağlanmış solvent tepsisi, gaz giderici, ikili pompa, otomatik örnekleyici ve DAD dedektöründen oluşan 1,200/1,260 serisi bir HPLC (Agilent, Waldbronn, Almanya) üzerinde gerçekleştirilmiştir. HMO’ların ekstraksiyonundan sonra bu ekstraktın 2.5 μL’si LC-MS sistemine enjekte edilmiştir. Oligosakaritler, 30 dakika boyunca bir su-metanol gradyanı ve 2 dakika ekilibrasyonu kullanılarak 2.1 x 10 mm’lik bir PGC ön-kolonlu (Thermo Scientific, ABD) 2.1 x 30 mm Hypercab gözenekli grafitleştirilmiş karbon (PGC) kolonu vasıtasıyla ayrılmıştır. Solvent A, su içinde %0.3 amonyum hidroksit çözeltisinden (%28-30, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri ABD) ve %95 metanol içinde %0.3 amonyum hidroksit çözeltisinden oluşan solvent B’den (tümü v/v) oluşmaktadır. Ön-ekilibrasyon %97.5 solvent A kullanılarak yapılmıştır. %97.5 solvent A ile 0.5 dakika süreyle başlayan gradyan, 12.5 dakikada %60’a, 3 dakikada %40’a inmiş ve burada 4 dakika tutulmuştur. Bir sonraki segmentte solvent A, 3 dakika tutulduğu yerde 0.5 dakikada %2.5’e düşmüştür. 0.5 dakikada solvent A, 6 dakikalık yeniden ekilibrasyon için %97.5’e yükselmiştir. Eluent akışı 400 μL/dk idi ve kolonlar 45 °C’de tutulmuştur.  LC-atık kütle spektrometresine online olarak infüze edilmiştir ve bireysel HMO yapıları, negatif iyon modunda çoklu reaksiyon izleme (MRM) ile yarı nicel olarak analiz edilmiştir. Pentaozlara kadar nötr HMO’lar ve triozlara kadar asidik HMO’lar için spesifik MRM geçişleri dahil edilmiştir. Püskürtme voltajı – 4500 V idi, kümeden arındırma potansiyeli ve çarpışma enerjisi, ölçülen bireysel bileşiklere göre optimize edilmiştir. Daha yüksek hassasiyet elde etmek için segmentli bir yöntem kullanılmıştır. Her MRM-geçişi 70 ms için ölçülmüştür. Cihaz, üreticinin talimatına göre polipropilen glikol (PPG) ile kalibre edilmiştir.

A.muciniphila kültürlerinden protein ekstraksiyonu. Akkermansia muciniphila, %0.5 saflaştırılmış müsin veya %10 anne sütü (4 biyolojik kopya) ile desteklenmiş bazal besiyerinde geliştirilmiştir. 37 °C’de 15 ve 48 saatlik inkübasyondan sonra hücreler (2 mL), 4 °C’de 30 dakika 4,816 x g’de peletlenmiş, 1 mL PBS içinde yeniden süspanse edilmiş, iki kez yıkanmış (4 °C’de 21,130 x g), ve son olarak 500 μL lizis tamponu (100 mM Tris HCl, pH 8.0, %4 (w/v) SDS, 7.7 mg/mL Dithiotreitol [DTT]) içinde yeniden süspanse edilmiştir. Hücreler, bir MS-72 probu kullanılarak buz üzerinde %20-30’luk bir genlikle sonikasyon (buz üzerinde 30 sn dinlenme ile 20 sn’lik dört darbe) ardından 4 °C’de 30 dakika boyunca 21,130 x g’de santrifüjleme ile parçalanmıştır. Hücre ekstraktlarının protein içeriğini belirlemek için üreticinin talimatlarına göre Qubit® Protein Test Kiti (Life Technologies, Oregon, ABD) kullanılmıştır. Protein numuneleri (müsin için 15 saat ve anne sütü örnekleri için 48 saat) (40 μg), XCell Surelock Mini-Cell kullanılarak bir Bolt %4-12 Bis–Tris Plus ayırma jeline (Invitrogen, Life Technologies, ABD) yüklendi ( Novex, Life Technologies, ABD). XCell Surelock Mini-Cell (Novex, Life Technologies, ABD) kullanılarak bir Bolt %4-12 Bis–Tris Plus ayırma jeline (Invitrogen, Life Technologies, ABD) yüklenmiştir. Elektroforez prosedürü üreticinin talimatlarına göre yapılmıştır. Jeller, QC Colloidal Coomassie Blue G250 boyası (Bio-rad Laboratories, ABD) kullanılarak gece boyunca boyanmıştır. 

A.muciniphila hücre ekstraktlarından elde edilen proteinlerin jel içi sindirim tanımlaması ve nispi miktar belirlemesi. Kullanılan jel şeritlerinin her biri, tanımlanan proteinlerin sayısını artırmak için üç dilime kesilmiştir. Dilimler ayrıca yaklaşık 1 mm²‘lik parçalar halinde işlem görmüştür ve daha önce belirtildiği gibi indirgeme, alkilasyon ve tripsin sindiriminden önce 1.5 mL düşük bağlayıcılı tüplere (Eppendorf) konulmuştur⁷⁰. Elde edilen süpernatant, LC–MS/MS analizi için kullanılmıştır. Örnekler, daha önce tanımlandığı gibi bir Proxeon EASY nLC ve bir LTQOrbitrap XL kütle spektrometresi ile nLC–MS/MS tarafından ölçülmüştür^71,72. LC–MS veri analizi daha önce açıklandığı gibi peptit ve protein düzeyinde 0.01’e ayarlanmış yanlış keşif oranları (FDR’ler) ve ek sonuç filtreleme ile (en az birinin benzersiz ve en az birinin değiştirilmemiş olduğu protein tanımlaması için gerekli minimum iki peptit) gerçekleştirilmiştir^70,73,74. Zıt yöne hareket eden veri tabanına karşı kalan tüm isabetler ve tüm insan proteinleri çıkarılmıştır. Fraksiyonlardaki proteinlerin bolluğunu analiz etmek için etiketsiz miktar ölçümü (LFQ) yoğunlukları karşılaştırılmıştır⁷⁵. Yeterli nicelenmiş peptit olmaması nedeniyle mevcut olmayan LFQ yoğunluk değerleri, ölçülen en düşük LFQ yoğunluk değerinden biraz daha düşük bir değerle değiştirilmiştir. Normal logaritma, MaxQuant’tan elde edildiği gibi protein LFQ MS1 yoğunluklarından alınmıştır. Numunenin kontrole göre nispi protein miktarının belirlenmesi, FDR 0.01’e ve S0’a 1’e ayarlı olarak elde edilen “LFQ yoğunluğu” kolonları kullanılarak iki numuneli bir T-testi uygulanarak Perseus⁷⁶ ile yapılmıştır. nLC-MSMS sistem kalitesi, MaxQuant sonuç dosyaları kullanılarak PTXQC⁷⁷ ile kontrol edilmiştir. Kütle spektrometrisi proteomik verileri, veri kümesi tanımlayıcısı PXD011357 ile PRIDE⁷⁸ ortak veri havuzu aracılığıyla ProteomeXchange Konsorsiyumuna depolanmıştır. Süt ve müsin koşulları arasında farklı şekilde eksprese edilen tüm A. muciniphila proteinleri Ek Tablo 5 ve 6’da listelenmiştir.

Seçilmiş A. muciniphila glikozit hidrolazlarının klonlanması, ekspresyonu ve saflaştırılması. Amuc_0010 (57.51 kDa), Amuc_0369 (72.02 kDa), Amuc_0771 (70.53 kDa), Amuc_1686 (85.71 kDa) ve Amuc_2136 (81.59 kDa)’nın sinyal peptitleri olmaksızın yer etiketlerine sahip genler tarafından kodlanan seçilmiş proteinleri pCDF-1b vektörüne klonlanmış ve C-ucunda bir 6xHis-etiketi ortaya çıkmıştır. İlgilenilen genler ve plazmit omurgası, Q5 DNA polimerazı (New England BioLabs, ABD) (Ek Tablo 1) kullanılarak gene özgü primerlerle PCR tarafından amplifiye edilmiştir.  Amplifiye edilmiş genler ve vektör, üreticinin talimatlarına göre NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB BioLabs, ABD) ile biraraya getirilmiştir.  E. coli DH5-aplha kompetent hücreler, 5 μL birleştirme reaksiyonu kullanılarak transforme edilmiştir ve diziler, Eurofins (Ebersberg, Almanya) tarafından DNA dizilimi ile doğrulanmıştır. E. coli BL21 Rosetta kompetent hücreleri, ilgili genleri barındıran rekombinant plazmit ile transforme edilmiştir. Rekombinant hücreler, 50 μg/mL spektinomisin ve 25 μg/mL kloramfenikol ile takviye edilmiş 250 mL Lizojeni-Broth (LB) içinde 0.5 ile 0.6 arasında bir OD₆₀₀‘e büyütülmüştür. Daha sonra 1 mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile 22 °C’de 16 saat süreyle indüklenmişlerdir. Hücreler, 20 dakika boyunca 6.000 x g’de santrifüjleme yoluyla toplanmış ve 15 mL lizis tamponu içinde yeniden süspanse edilmiştir. Hücreler, bir MS-72 mikrotipi (Bandelin, Almanya) kullanılarak buz üzerinde sonikasyon ile (10 dakika boyunca 2 saniye dinlenme ile 1 saniye titreşim, %20-25 genlik) parçalanmıştır. Lizat, 4 °C’de 1 saat boyunca 120,000 x g’de santrifüj edilerek temizlenmiştir. Proteinler, bağlama tamponu ile dengelenmiş Ni²⁺-nitrilotriasetat (Ni-NTA) agaroz afinite kolonları (500 μL yatak hacmi, Qiagen) kullanılarak His-etiketi saflaştırılmıştır. Örnekler yüklenmiş, ardından 2 mL bağlama tamponu ve 2 x 500 μL ve 1 mL elüsyon tamponu eklenmiştir. Enzimlerin saflığı, SDS-Page (%4-10 poliakrilamid jel) (Ek Şekil 2) ile kontrol edilmiş ve saf numuneler, depolama tamponlu 50-kDa MWCO Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Üniteleri (Merck, Almanya) kullanılarak konsantre edilmiştir. Protein içeriği Qubit Protein Assay (üreticinin protokolü) ve florometre (DeNovix, ABD) kullanılarak ölçülmüştür. pCDF-1b boş vektörü klonlanmış, eksprese edilmış ve yukarıda belirtildiği gibi saflaştırılmıştır. Boş vektör, tüm enzimatik deneylerde negatif kontrol olarak kullanılmıştır.

Aktivite deneyleri ve kinetik. Saflaştırılan enzimler, 37 °C’de her enzimin optimum pH’ına ayarlanmış McIlvaine tampon çözeltisi içinde farklı substratlarla inkübe edilmiştir. α-fukosidaz, β-galaktosidaz ve β-asetilheksosaminidaz aktivitesini sentetik substratlar üzerinde ölçmek için, 4-nitrofenil-α-L-fukopiranozid (pNP-α-L-Fuc), 4-nitrofenil-b-D-galaktopiranosid (pNPG) ve 4-nitrofenil 2-asetamido-2-deoksi-b-D-glukopiranozid (GlcNAc-p-pNP) sırasıyla kullanılmıştır. Enzimler, Mcllvaine tamponu içinde 0 ila 5 mM arasında değişen substrat konsantrasyonları ile inkübe edilmiştir. 2.5 dakikalık aralıklarla numuneler alınmış ve reaksiyonu durdurmak için 2.5 x hacim glisin tamponuna (pH 9.6) eklenmiştir. Absorbans 405 nm’de izlenmiş ve 4-Nitrofenol (pNP) standart eğrisi kullanılarak miktar belirlenmiştir. Her enzimin optimal pH’ını belirlemek için analiz, pH değerleri 5.0 ile 8.2 arasında değişen ve başlangıç pH’ında belirlendiği gibi K_M‘nin ~3 katı bir substrat konsantrasyonuna sahip McIlvaine tamponunda gerçekleştirilmiştir. Daha sonra, 0-5 mM substrat ile yukarıda bahsedilen deneyler, optimal pH’da tekrarlanmıştır. β-galaktosidazlar ve heksosaminidazların laktoz ve LNT ile inkübasyonu için analizler benzer şekilde yapılmıştır, ancak ürünler HPAEC-PAD ile izlenmiştir. Şekerler, bir koruma kolonu ile korunan bir CarboPac PA20 üzerinde 0.5 mL/dk’da 10 mM NaOH ile HPAEC ile ayrılmış ve bir Dionex ICS5000 sisteminde (Thermo Scientific) PAD kullanılarak tespit edilmiştir. Sonuçları ölçmek için farklı konsantrasyonlarda galaktoz ve glikoz standartları kullanılmıştır. α-fukosidazın 2′-FL ile inkübasyonu için reaksiyonlar benzer şekilde gerçekleştirilmiştir ancak fukoz salınımı, fukoz dehidrojenaz-bağlı bir yönteme dayalı olarak α-L-fukoz kiti (Megazyme, İrlanda) tarafından doğrudan (önce glisin tamponu eklenmeden) ölçülmüştür⁷⁹. Enzimsiz ve hem sentetik hem de anne sütünden türetilen şekerlerde inkübe edilen yalnızca saflaştırılmış plazmit ile reaksiyonlar, negatif kontroller olarak kullanılmıştır. Enzimlerin kinetik verileri üçlü deneylerden elde edilmiştir. Kinetik parametreler, lineer regresyon analizi ve hata çubukları (SD) kullanılarak ilk ham verilerin Michaelis-Menten denklemine yerleştirilmesiyle hesaplanmıştır. 

Hücre lizatı aktivitesi. A. muciniphila hücre lizatlarının enzimatik aktivitesi, daha önce belirtildiği gibi kolorimetrik substratlar ile test edilmiştir⁸⁰. Aşağıdaki substrat/enzim kombinasyonları kullanılmıştır: 4-nitrofenil-α-L-fukopiranozid/fukosidaz (pNP-Fuc), 4-nitrofenil-β-D-galaktopiranosid (pNPG) ve 2-nitrofenil-β-D-galaktopiranosid (ONPG) )/β-galaktosidaz ve 2′-(4-metilumbelliferil)-α-D-N-asetilnöraminik asit (MU-NA)/sialidaz. Reaksiyonlar 0.05 M sitrat tamponu pH 6.0 (fukosidaz, sialidaz) veya 0.25 M fosfat tamponu, pH 7.0 (β-galaktosidaz) içinde 0.5-2.5 mM substrat ve ~1 μg/mL enzim kullanılarak 20 μL’lik bir son hacimde gerçekleştirilmiştir. 37 °C’de 1 saatlik inkübasyondan sonra, 50 μL 0.5 glisin tamponu eklenerek pH 9.6’da reaksiyonlar durdurulmuştur. Absorbans 405 nm’de (pNPG ve pNP-Fuc) veya 420 nm’de (oNPG) okunmuş ve floresan yoğunluğu 96 oyuklu bir plaka okuyucuda (Biotek, ABD) λ_ex 390 nm, λ_em 460 nm’de ölçülmüştür. Aktivite, birim (U) cinsinden ifade edilmektedir; burada bir birim, dakikada 1 µmol substratı dönüştüren enzimin miktarıdır. 2′-FL ve laktozdaki hücre lizatlarının fukosidaz ve galaktosidaz aktivitesini test etmek için, her enzimden ~10 μg/mL, 0.05 mM sitrat tamponunda pH 6.0, 1 mL’lik bir son hacimde, 300 rpm’de çalkalanarak 1 mM laktoz ve 1 mM 2′-FL ile inkübe edilmiştir. Alikotların farklı zaman noktalarındaki reaksiyonları, 2.5 x 0.5 M glisin tamponu hacmi eklenerek pH 9.6’da durdurulmuştur. Reaksiyon, daha önce belirtildiği gibi HPAEC-PAD ile izlenmiştir. 

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi. Fermantasyon ürün analizi için, inkübasyon süresinin farklı zaman noktalarında numuneler alınmıştır. İç standart olarak krotonat ve dış standartlar olarak laktat, format, asetat, propionat, butirat, süksinat, 1,2-propanediol, laktoz, N-asetil-glukozamin (GlcNAc), N-asetil-galaktozamin (GalNAc), 2′-fukosillaktoz (2′-FL), 3′-sialillaktoz (3′-SL), glukoz, galaktoz, fukoz ve sialik asit kullanılmıştır. Substrat dönüşümü ve ürün oluşumu, 45°C’de tutulan ve eluent olarak 0.0005 mM sülfürik asit sıvısı bir Varina Metacarb 67H 300 x 6.5 mm kolon ile donatılmış Thermo Scientific Spectrasystem yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) sistemi ile ölçülmüştür. Eluent, 0.5 mL/dk’lık bir akışa sahiptir ve metabolitler, kırılma indeksi (RI-150) belirlenerek tespit edilmiş ve daha önce belirtildiği gibi saf bileşiklerin standartları kullanılarak tanımlanmıştır⁸¹.

İstatistiksel analiz. İstatistikler, öğrencinin t testi kullanılarak yapılmış ve Yanlış Keşif Oranı (FDR) kullanılarak çoklu test için düzeltilmiştir. Veriler aksi belirtilmedikçe ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur. 0.05’in altındaki P değerleri anlamlı kabul edilmiştir.